绵羊MYF6基因多态性对胴体瘦肉性状的影响

鲁玉洁，周辉通,2，柯 娜，王继卿，黄兆春，梁维炜，甄慧敏，罗玉柱，刘 秀，李少斌

(1 甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃省牛羊基因改良工程实验室，甘肃 兰州 730070；2 新西兰林肯大学 农业与生命科学学院，新西兰 林肯 7647)

胴体性状是绵羊育种和生产中的一个重要性状，显著影响绵羊的养殖效益。研究发现，肌纤维数量和大小是影响绵羊产肉性能的关键因素[1]。在出生前后，动物肌纤维的发育有明显差异，在胚胎时期，肌纤维数量大量增加；个体出生后，肌纤维数量维持不变，但直径显著增大，导致个体产肉量不断提高[2]。肌卫星细胞是一种肌源性干细胞，在其发育为肌管的过程中，受到生肌调节因子家族(myogenic regulatory factors，MRFs)的影响[3]，生肌因子6(myogenic factor 6，MYF6)是其中的一员，MYF6基因由3个外显子组成[4]。

MYF6基因在肌肉发生、肌管和肌纤维肥大等过程中发挥着重要作用[5-6]。敲除MYF6基因后，小鼠出现肌肉发育延迟、功能不全等现象[7]。另外，MYF6基因在小鼠胚胎期第16天(此时肌管大量分化)高度表达，说明该基因具有促进肌管分化的作用[8]。除此之外，MYF6对动物出生后肌肉的生长发育也至关重要，Yin等[9]发现，在肌纤维直径较大的鸡上，MYF6基因表达量显著上调，这表明该基因可促进鸡肌纤维的发育。

MYF6基因的变异会显著影响畜禽的产肉能力。Wyszynska-Koko等[10]研究发现，MYF6基因的c.-335 T>C突变与波兰大白猪的右半胴体质量显著相关(P<0.05)。贾伟德[11]研究发现，黄牛MYF6基因的131 T>G突变会影响肌内脂肪含量等肉品质性状(P<0.05)。MYF6基因的核苷酸序列变异也显著影响着鹅[12]、鸭[13]等动物肌肉的生长发育和肉的品质。目前，学者们已研究了绵羊MYF6基因的甲基化水平[14]及其在肌肉中的表达量[15]和其对绵羊部分屠宰性状[1]的影响(P<0.05)，但尚未见关于其对绵羊胴体瘦肉性状影响的研究报道。

本研究采用PCR-SSCP和测序等技术，检测了第1外显子和5′UTR区域的多态性，分析了序列变异对绵羊腰部瘦肉量等7种肌肉性状的影响，并研究了MYF6基因在绵羊背最长肌等8个组织中的表达特征，以期为绵羊胴体性状的改良提供有效的分子遗传标记。

1 材料与方法

1.1 罗姆尼羊胴体性状数据和基因DNA的采集

以13只产肉性能优良的罗姆尼公羊作为父本，采用人工授精技术与罗姆尼经产母羊进行配种。在所产后代羔羊中，挑选215只出生日期接近的公羔，详细记录其耳号、初生体质量和出生等级(单羔、双羔或多羔)。

用VIASCAN(Video Imaging Analysis System,VIASCAN)仪器测量羔羊胴体瘦肉率的精确度(达0.52)远高于传统的热胴体质量和GR值预测法(精确度均为0.19)，该方法还具有稳定性高、节省人力、可预测脂肪深度等优点，在自动化预测产肉量方面具有巨大潜力[16]。本研究选取12周断奶羔羊，称取体质量后立即屠宰，用VIASCAN仪器测定其肩部、腰部和后腿3个部位的瘦肉量(以瘦肉质量占胴体质量的百分比表示)，计算总瘦肉量(3个部位瘦肉量之和)及这3个部位瘦肉量占总瘦肉量的比例(瘦肉率)[17]。羔羊屠宰前采集血液，提取DNA[18]，用于后续试验。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank中绵羊MYF6基因序列(GenBank登录号：NM_001134782.1)，设计3对特异性引物P1、P2和P3(表1)，其中P1和P2引物分别用于扩增MYF6基因的第1外显子(556 bp)和5′UTR(476 bp)区域，P3引物用于MYF6基因在各组织中表达水平的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测,内参基因为β-actin。试验所用引物及其序列见表1。

表1 试验所用的引物信息Table 1 Primers used in the study

1.3 MYF6基因第1外显子和5′UTR多态性的PCR-SSCP分析

PCR扩增MYF6基因第1外显子和5′UTR。反应体系为：预混酶(10 U/μL)10 μL，上、下游引物(0.25 μmol/L)各0.8 μL，血液DNA(100 ng/μL) 0.8 μL， ddH2O 7.6 μL。PCR反应参数为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，降温至4 ℃结束。

取PCR扩增产物0.7 μL，加SSCP变性缓冲液7 μL，在PCR仪上于100 ℃条件下变性6 min之后，迅速点样于聚丙烯酰胺凝胶中，在Bio-Rad(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)的Protean Ⅱ xi系统中进行电泳。第1外显子的电泳条件为：12%凝胶、14 ℃、390 V电泳18 h；5′UTR的电泳条件为：14%凝胶、25 ℃、200 V电泳18 h。对凝胶进行银染显色[19]，读取样本的基因型。

1.4 等位基因序列测定

根据基因型，选择适宜的方法测序：对于纯合子，直接进行Sanger测序；对于杂合子(无纯合子个体)，则按照Gong等[20]建立的方法切取其中的纯合型条带进行测序。试验设3个生物学重复，以保证结果的可靠性。

用DNAMAN(V.5.2.10)比对MYF6等位基因间核苷酸序列的差异，用POPGENE软件(V.3.2)计算MYF6基因第1外显子和5′UTR区域的等位基因频率、基因型频率、χ2值(Hardy-Weinberg平衡性检验)。

1.5 MYF6基因多态性对羔羊胴体性状的影响

采用SPSS20.0软件的一般线性混合效应模型(general liner mixed-effect models,GLMMs)，分析第1外显子基因型对公羔后腿、腰部、肩部瘦肉量及瘦肉比例和总瘦肉量等7个瘦肉性状的影响。由于父本和初生体质量影响了羔羊的瘦肉性状(P<0.01)，因此在该模型中，将父本和初生体质量作为随机效应。由于所有羔羊均饲养于同一农场(饲养条件一致)，因此在模型中未考虑环境因素[17]。

1.6 MYF6基因在绵羊8个组织中的表达谱

在甘肃省武威市天祝县一绵羊养殖场，选取3周岁、体况良好的3只小尾寒羊母羊。屠宰后采集其乳腺、肝脏、心脏、背最长肌、脾脏、肺脏、卵巢和肾脏等组织，去除表面杂质和血渍后，放入液氮带回实验室保存。用TRIzol Reagent(Invitrogen,CA,USA)试剂盒提取绵羊上述8个组织的总RNA，反转录合成cDNA。以β-actin为内参基因，采用实时荧光定量PCR法检测MYF6基因在各组织中的表达水平。RT-qPCR反应体系为：100ng/μL的cDNA 2μL，0.25 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，10 μmol/L的SYBR qPCR Master Mix 10 μL和RNase-free ddH2O 7.2 μL。RT-qPCR的具体反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45个循环。试验设3个生物学重复和3次技术重复。采用2-ΔΔCt方法计算并比较MYF6基因在上述各组织中的相对表达量[21]。

2 结果与分析

2.1 MYF6基因第1外显子的遗传特征

经PCR-SSCP分析，MYF6基因第1外显子检测到A和B 2个等位基因，存在AA和AB 2种基因型(图1)；测序结果表明，2个等位基因间存在c.129 C>T同义突变的单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphism,SNP)(图2)。等位基因A和B的频率分别为89.30%和10.70%，基因型AA和AB的频率分别为78.60%和21.40%，群体的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.08)。

1,2,4.AA基因型；3,5.AB基因型1,2,4.AA genotypes；3,5.AB genotypes图1 绵羊MYF6基因第1外显子区域的PCR-SSCP分析Fig.1 Analysis of the exon 1 region of MYF6 by PCR-SSCP

图2 绵羊MYF6基因第1外显子区域的SNP测序峰图Fig.2 Sequencing of SNP in the exon 1 region of MYF6

2.2 MYF6基因5′UTR区域的遗传特征

经PCR-SSCP分析，在MYF6基因5′UTR区域检测到C和D 2个等位基因，存在CC和DD 2种基因型(图3)；测序结果(图4)表明，与等位基因D的序列相比，等位基因C的序列中存在3 bp的碱基(c.-589～-590 del ATA)缺失。等位基因C和D的频率分别为98.37%和1.63%,基因型CC和DD的频率分别为96.74%和3.26%。在该研究区域，群体的基因型频率也符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.82)。

图4 绵羊MYF6基因5′UTR区域的测序峰图Fig.4 Sequencing of 5′UTR region of MYF6

2.3 MYF6基因第1外显子基因型对绵羊公羔胴体性状的影响

在MYF6基因的第1外显子区域上，2个基因型的频率均大于5%，因此被用于对绵羊公羔胴体性状的影响分析；而在5′UTR区域检测到的2个基因型中，DD型的频率小于5%，无法进行相关分析。MYF6基因第1外显子基因型对绵羊公羔胴体性状影响的分析结果见表2。由表2可知，MYF6基因第1外显子基因型对羔羊的后腿瘦肉量、腰部瘦肉量、肩部瘦肉量、总瘦肉量和腰部瘦肉比例均有极显著影响(P<0.01)，AA型个体的后腿瘦肉量、腰部瘦肉量、肩部瘦肉量和总瘦肉量分别较AB型高0.5%，0.7%，0.5%和1.7%，但对后腿瘦肉比例和肩部瘦肉比例无明显影响(P>0.05)。

1,2,4.CC基因型；3.DD基因型1,2,4.CC genotypes；3.DD genotypes

表2 MYF6基因第1外显子基因型对羔羊瘦肉性状的影响Table 2 Effect of genotypes in ovine MYF6 exon 1 on lean traits in male lambs

2.4 MYF6基因在绵羊8个组织中的相对表达量

由图5可知，MYF6基因在绵羊背最长肌、卵巢、肺脏、脾脏、肾脏、肝脏和乳腺等8个组织中均有表达，但以背最长肌中的相对表达量最高，其余依次为卵巢、肺脏、脾脏、肾脏、肝脏、乳腺和心脏，其在背最长肌中的相对表达量分别是上述组织的86，104，108，109，171，1 308和13 841倍(P<0.01)。MYF6基因在卵巢、肺脏、脾脏和肾脏中的相对表达量之间无明显差异(P>0.05)，但均显著高于其在肝脏、乳腺和心脏组织中的相对表达量。

图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) and difference capital letters indicate extremely significant difference (P<0.01)图5 MYF6基因在绵羊不同组织中的表达水平Fig.5 Expression levels of ovine MYF6 in different tissues

3 讨 论

本研究在绵羊MYF6基因的第1外显子上发现了1个同义突变的SNP(c.129 C>T)，虽然这个SNP不能改变编码的氨基酸，但其作用不容忽视，因为该SNP有可能与MYF6基因其他重要区域的SNPs连锁，从而调控MYF6基因的表达量或改变编码蛋白的功能。有研究发现，同义突变的SNPs也能影响mRNA的生成效率和稳定性，以及蛋白质的生成效率和空间构象，最终改变基因的功能[22]。Maak等[23]在人、小鼠、狗、鸡和斑马鱼等物种上的研究发现，MYF6基因的启动子区域中存在7个SNPs。前人分别在山羊和鸡MYF6基因的外显子上发现了2个和1个SNP[24-25]。本研究发现的SNPs在上述研究中均未报道，且此SNP形成的2个基因型间的部分胴体性状存在显著差异。本研究在5′UTR区域也发现了1个3 bp的碱基缺失，但由于在本研究选用的215只罗姆尼羊中，这个核苷酸变异产生的等位基因D的频率仅为1.63%，故无法研究该碱基缺失对绵羊胴体性状的影响。前人对其他基因5′UTR区域的研究发现，此区域的碱基缺失具有重要作用，例如Bi等[26]对内蒙古白绒山羊的研究发现，MSTN基因5′UTR区域的1个5 bp的碱基缺失对胸部深度有极显著影响(P<0.01)；卢靖坤[27]在牛的MSTN上发现，5′UTR区域1个11 bp的碱基删除造成了蛋白活性区域失活，最终形成了牛的双肌表型。因此，建议将来在其他绵羊品种上，或用更多的绵羊样本来进一步研究MYF6基因5′UTR区域c.-589～-590 del ATA对绵羊胴体性状的影响。

卡方检验发现，在绵羊MYF6基因的5′UTR区域和第1外显子区域内，羔羊的群体遗传结构符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。这说明本研究所使用的罗姆尼羊群体未受到明显的人工选择压力，也未受到迁移、严格选配等其他因素的影响。因此，在以后的育种实践中，建议加强人工选择和选种选配，从而提高该群体的瘦肉量和瘦肉率。

王鑫等[28]的研究发现，MYF6基因在山羊背最长肌中的表达量高于肝脏等其他组织。曹婷等[29]在猪上的研究发现，MYF6基因在肌肉中的表达量最高，在心脏中的表达量最低。本研究RT-qPCR结果显示，MYF6基因在绵羊卵巢等8个组织中均有表达，其中在背最长肌中的表达量最高，在心脏中的表达量最低(P<0.05)，这与其生物学作用有关。有研究表明，动物出生后随着肌纤维的发育，MYF6在mRNA水平和蛋白水平的表达量随之增加[30]，说明MYF6基因在动物生后肌纤维肥大过程中发挥着重要作用[5]。曹婷等[29]研究发现，MYF6在猪的肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中均有表达，但目前尚未见该基因在动物卵巢和乳腺中表达情况的报道。本研究发现，除了肌肉和心脏组织以外，MYF6在卵巢、乳腺、脾脏、肝脏、肾脏和肺脏中也有表达。

有学者发现，MYF6基因的基因型对动物肌肉量有显著影响，如郭月英等[1]发现，AB型绵羊的眼肌面积大于AA型绵羊个体；孙文浩[25]发现，AA型鸡具有更大的产肉量和胸肌、腰肌质量(P<0.05)。本研究分析结果表明，MYF6第1外显子的基因型对羔羊的瘦肉量有极显著影响(P<0.01)，AA型个体的后腿瘦肉量、腰部瘦肉量、肩部瘦肉量和总瘦肉量分别较AB型高0.5%，0.7%，0.5%和1.7%。在发达国家的市售羊肉中，腰部和腿部的瘦肉都是肉质较好的上等肉，特别是腰部的瘦肉，能被烹饪成法式羊排等附加值极高的食品。鉴于MYF6基因对绵羊后腿部、腰部和总瘦肉量的显著影响，以及这3个部位瘦肉的良好品质，该基因可以作为一个分子标记，用于提高绵羊的胴体瘦肉量。

4 结 论

在绵羊MYF6基因的第1外显子中发现了1个SNP，在5′UTR区域发现了1个3 bp的碱基缺失(c.-589～-590 del ATA)。MYF6基因在绵羊背最长肌中的表达量最高，其基因型极显著影响了羔羊的瘦肉性状，可以作为分子标记用于提高羔羊的酮体瘦肉量。