富源酸菜源乳酸菌分离鉴定及益生特性研究

叶朋飞 刘静 李秋达 周杰 黄杰秋 杜艳琼

摘 要：目的：從自然发酵富源酸菜中分离乳酸菌，研究其益生特性，为乳酸菌益生菌制剂研发提供基础数据。方法：采集自然发酵的富源酸菜样品，使用MRS培养基分离乳酸菌，研究其耐酸、耐胆盐、抑菌活性和抗生素敏感性等益生特性，并采用16S rDNA基因序列分析法进行鉴定。结果：分离得到MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2 4株菌株，16S rDNA序列分析结果表明，MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2分别为植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、德氏乳杆菌和发酵乳杆菌;与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG相比，戊糖乳杆菌MH-4和德氏乳杆菌ZY-3具有较强的耐受性和抑菌活性;抗生素敏感性试验结果显示，戊糖乳杆菌MH-4对氯霉素、红霉素中度敏感，德氏乳杆菌ZY-3对氯霉素敏感、对红霉素中度敏感。结论：从富源酸菜中分离得到植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、德氏乳杆菌和发酵乳杆菌4株乳酸菌，戊糖乳杆菌MH-4和德氏乳杆菌ZY-3具有显著耐受性、抑菌活性和抗生素敏感性等益生特性，可作为微生态制剂候选菌株开展深层次研究。

关键词：富源酸菜;乳酸菌;益生特性;抑菌活性;抗生素敏感性

Isolation， Identification and Probiotic Properties of Lactic Acid Bacteria from Fuyuan Sauerkraut

YE Pengfei， LIU Jing， LI Qiuda ， ZHOU Jie， HUANG Jieqiu， DU Yanqiong

（Department of Modern Agriculture， Qujing Vocational and Technical College， Qujing 655000， China）

Abstract： Objective： To provide basic data for the research and development of lactic acid bacteria probiotic preparations by isolating lactic acid bacteria from natural fermented Fuyuan sauerkraut and then studying its probiotic properties. Methods： MRS medium was used to isolate suspected lactic acid bacteria from samples of Fuyuan sauerkraut to study its probiotic properties， such as acid resistance， bile resistance， antibacterial activity and antibiotic sensitivity. And  16SrDNA sequence analysis was also applied to identify the lactic acid bacteria above. Results： Four strains， MH-3， MH-4， ZY-3 and YS-2， were isolated. According to 16S rDNA sequence analysis， MH-3， MH-4， ZY-3 and YS-2 were identified as Lactobacillus plantarum， Lactiplantibacillus pentosus， Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus fermentum， respectively. Compared to the reference strain Lactobacillus rhamnosus LGG， both

L. pentosus MH-4 and L. delbrueckii ZY-3 showed greater tolerance and higher antimicrobial activity. Test results of antibiotic sensitivity showed that L. pentosus MH-4 was moderately sensitive to chloramphenicol and erythromycin， and L.delbrueckii ZY-3 was sensitive to chloramphenicol and moderately sensitive to erythromycin. Conclusion： Four LAB strains， Lactobacillus plantarum， Lactiplantibacillus pentosus， Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus fermentum were isolated from Fuyuan sauerkraut. Among them， L. pentosus MH-4 and  L. delbrueckii ZY-3， with better performance in probiotic properties， like tolerance， antimicrobial activity and antibiotic sensitivity， were proved to be candidates for further in-depth research for microecological preparations.

Keywords： Fuyuan sauerkraut; lactic acid bacteria; probiotic properties; antibacterial activity; antibiotic sensitivity

富源酸菜是云南省富源县农村常见的一种酸菜，以萝卜、新鲜青菜、玉米面和水为原料，不添加其他原料，经自然发酵等工艺制成的食品[1]。富源酸菜富含膳食纤维、钙、磷、铁和硒等营养物质，具有健胃消食、减肥消暑、醒酒去腻等功效，因其特有的风味受到人们的喜爱。2016年12月，富源酸菜协会成功将富源酸菜和富源酸菜猪脚火锅制作技艺申报列为曲靖市非物质文化遗产保护名录。富源酸菜生产主要以家庭小作坊式为主，发酵过程大部分是在开放的环境中进行的，参与自然发酵的微生物种类较多。目前，关于富源酸菜有益微生物资源的分离、鉴定及相关研究尚未见文献报道。本研究从富源酸菜中分离鉴定乳酸菌并进行益生特性研究，为挖掘、利用微生物资源，提升传统发酵食品营养及功能品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

样品采自云南省富源县传统自然发酵酸菜。

1.1.2 指示菌和参考菌株

大肠杆菌（Escherichia coli）CMCC44102、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC（B）50041、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri），上海保藏生物技术中心;鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG由本实验室保存。

1.1.3 试剂与仪器

MRS肉汤及琼脂培养基、维生素C、石蜡油、胆盐，索莱宝生物科技有限公司;革兰氏染色剂，南京建成科技有限公司;厌氧产气袋，MGC日本三菱有限公司;标准药敏片，常德比克曼生物科技有限公司。

高压灭菌锅YX-18L-M，江阴滨江医疗设备有限公司;超纯水仪，美国MILLIPORE公司;超低温冰箱，ULT1386-3-V41 Thermo;涡旋混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂;微波炉M3-L236E金色，广东美的厨房电器制造有限公司;单人单面净化工作台CJ-2D、生化培养箱SPX-70BⅢ，天津市泰斯特仪器有限公司;电子天平214A，上海豪晟科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

参照罗强等[2]方法，采集云南省富源县农家天然发酵酸菜样品，用无菌移液器吸取混合均匀的酸菜汁液快速装入30%的无菌甘油管中，置于采样箱中，冰浴状态下带回实验室，-80 ℃保存备用。

1.2.2 乳酸菌分离

将保存于30%甘油中的样品进行10倍梯度稀释，按1%比例接种到添加0.1%抗坏血酸的MRS肉汤中，37 ℃厌氧条件下培养24 h，富集后将培养液梯度稀释接种于1%碳酸钙-MRS琼脂培养基上，37 ℃厌氧培养48 h，挑取菌落形态不同，并有明显溶钙圈的单菌落，纯化3次后保存备用[3]。

1.2.3 乳酸菌鉴定

（1）革兰氏染色、接触酶试验。将分离得到的菌株分别进行革兰氏染色试验、接触酶测定试验鉴定。

（2）分子生物学鉴定。分离得到的4株疑似菌株委托安徽通用生物科技有限公司进行16S rDNA测序，测定序列后分析比对并通过clustalX 2.0和Mega 4.0软件构建系统发育树对分离得到菌株进行鉴定[4]。

1.2.4 益生特性研究

（1）耐受性试验。①酸耐受试验。参照许强等[5]方法，接种单菌落于10 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养16 h，按5%比例接种到pH=2.0和pH=3.0的MRS液体培养基中，在pH=2.0的条件下孵育1 h，在pH=3.0的条件下孵育3 h，用平板计数计算乳酸菌菌落数，并与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG比较。②胆盐耐受试验。接种单菌落于10 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养16 h，按5%比例接种于不同胆盐水平（0.1%和0.3%）的MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h，用平板计数计算乳酸菌菌落数，并与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG比较。

（2）对主要肠道致病菌的抑菌作用。参照邹建华等[6]采用琼脂打孔扩散法研究菌株的培养上清液（pH值调整至6.2）对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌的抑制作用，并与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG比较。

（3）抗生素敏感性试验。参照邹建华等[6]采用滤纸片扩散法，分析4株乳酸菌的抗生素敏感性，试验用抗生素的种类、药敏纸片含药量及抑菌圈直径判断标准见表1。

1.2.5 数据分析与统计

数据用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，差异显著者进行Ducan’s多重比较，结果用平均值±标准误表示，显著水平设置为P=0.05。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离、革兰氏染色和过氧化氢酶试验结果

采用含碳酸钙的MRS选择性培养基从自然发酵富源酸菜中分离选出4株具有较强产酸能力的乳酸菌，编号分别为MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2。将分离得到的4株菌株进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验，检测结果见表2。4株菌株革兰氏染色结果均为阳性，过氧化氢酶试验结果均为阴性，初步判定为乳酸菌。

2.2 16S rDNA序列分析

2.2.1 序列的同源性分析

使用NCBI数据库的BLAST软件，对分离、纯化后4株菌株的16S rDNA序列进行同源性比对，结果如表3所示。

由表3可知，MH-3与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的16S rDNA的相似性达99.63%，MH-4与戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）的16S rDNA的相似性達99.55%，ZY-3与德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）的16S rDNA的相似性达99.93%，YS-2与发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）的16S rDNA的相似性达100.00%。

2.2.2 系统发育分析

下载与分离菌株具有较近亲缘关系的模式菌株16S rDNA序列，采用邻位相连法构建系统发育树，结果如图1所示。MH-3与植物乳杆菌（L. plantarum）系统位置最近，MH-4与戊糖乳杆菌（L. pentosus）系统位置最近，ZY-3与德氏乳杆菌（L. delbrueckii）系统位置最近，YS-2与发酵乳杆菌（L. fermentum）系统位置最近。综合16S rDNA序列同源性分析和系统发育树构建结果，MH-3鉴定为植物乳杆菌（L. plantarum），MH-4鉴定为戊糖乳杆菌（L. pentosus），ZY-3鉴定为德氏乳杆菌（L. delbrueckii），YS-2鉴定为发酵乳杆菌（L. fermentum）。

2.3 益生特性研究

2.3.1 耐受性试验

益生菌乳酸菌的重要特点是菌株应具备一定的耐酸和耐胆盐性能，以顺利通过胃酸的消化作用进入肠道发挥作用[7]。将分离、纯化后的4株菌株分别在pH=3.0、pH=2.0、0.1%胆盐、0.3%胆盐条件下进行处理，存活率如表4所示。结果显示，与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG相比，MH-3、MH-4和ZY-3有较强的酸耐受性，YS-2酸耐受性较差;MH-4和ZY-3胆盐耐受能力与参考菌株相当。

2.3.2 对主要肠道致病菌的抑菌活性

益生菌乳酸菌发挥促进肠道微生态平衡作用，关键益生性能是对肠道致病菌的抑菌活性。用4株菌株的培养上清液（pH值调整至6.2）研究对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌的抑制作用，结果见表5。MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌的抑制活性均显著优于参考菌株LGG。

2.3.3 抗生素敏感性试验

抗生素敏感性是评价益生菌安全性的重要指标之一。本研究采用滤纸片扩散法分析4株乳酸菌的抗生素敏感性。抗生素敏感性的判定参照CLSI最新版的标准进行，试验结果见表6。MH-3、ZY-3和YS-2对氯霉素敏感，MH-4对氯霉素中度敏感;MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2对红霉素中度敏感;MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2对四环素、万古霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素和氨苄西林耐药。

3 结论与讨论

益生菌是一类摄入足够量时对宿主机体健康有益的活性微生物的总称[8]。大量研究证实，益生菌具有调节胃肠道微生态平衡、促进机体物质代谢、增强机体免疫功能等益生特性，其保健功能越来越受关注[9]。目前，益生菌的主要种类包括乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌等。其中，乳酸菌是最主要的益生菌种类，在世界范围内被公认为安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）等级的食品微生物[10]。传统发酵食品制作过程的实质是富集、驯化与培养种类各异的微生物，这些微生物代谢产生的风味物质造就了传统发酵食品的独特风味与丰富营养[11]。国内外已有许多研究致力于分离传统发酵食品中具有抗菌、益生等功能的菌株。因此，从传统发酵食品中筛选益生特性较好的乳酸菌，在改善发酵食品风味品质、开发乳酸菌微生态制剂等方面具有较好的研究价值和开发前景。

自然发酵酸菜是我国的传统特色发酵食品，经长期的自然选择和驯化，其中含有丰富的乳酸菌，是研究和开发有益菌群的天然宝库[12]。许强等[5]从川西彝族酸菜汁中分离得到能耐受0.5%胆盐浓度的环境、在pH=2和pH=3的环境中培养180 min后活菌数均大于106 CFU/mL的植物乳杆菌、副植物乳杆菌和副干酪乳杆菌。罗强等[2]从中国北方4个不同地区的20份传统自然发酵泡菜样品中分离得到在pH=2.0条件下处理3 h存活率在70%以上的7株乳杆菌和2株肠球菌。龚加路等[13]从川南四市收集的9份农家泡菜中分离得到1株对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌抑菌圈直径达38.40 mm、16.50 mm，对0.3%～0.5%浓度胆盐有良好耐受性的戊糖乳杆菌。李旭阳等[14]从宁夏银川市采集的家庭自制的3份发酵泡菜中分离得到5株产酸较多的乳酸菌，其中瑞士乳杆菌NXU_19022的耐酸、耐胆盐及生长性能较好，在6 h左右优先进入生长对数期，其在pH为2时的存活率约为92%，在牛胆盐含量百分比为0.9%时的存活率约为18%。XU等[15]从中国东北酸菜中分离的干酪乳杆菌NA-2可抑制蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157：H7的生长。本研究从富源酸菜中分离得到MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2 4株乳酸菌，16S rDNA序列分析表明，MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2分别为植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、德氏乳杆菌和发酵乳杆菌。与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG相比，戊糖乳杆菌MH-4和德氏乳杆菌ZY-3具有较强的耐受性和抑菌活性;抗生素敏感性试验结果显示，戊糖乳杆菌MH-4对氯霉素、红霉素中度敏感，德氏乳杆菌ZY-3对氯霉素敏感、对红霉素中度敏感。因此，戊糖乳杆菌MH-4和德氏乳杆菌ZY-3拥有良好的耐受性、抗菌活性和抗生素敏感性，可作为微生态制剂候选菌株开展深层次研究。

参考文献

[1]HUANG H，PAN L，YANG L，et al.Reduce Fuyuan sour pickled cabbage nitrite content of research[J].The Food Industry，2018，39（4）：162-166.

[2]罗强，李幸洋，陈炼红，等.传统发酵泡菜中乳酸菌种群组成及优良菌株产酸耐酸特性分析[J].食品科学，2021，42（2）：158-163.

[3]王夫杰，魯绯，渠岩，等.腐乳中乳酸菌的分离与鉴定[J].中国调味品，2010，35（7）：98-101.

[4]田芮佼.云南传统发酵食品中乳酸菌的分离鉴定及益生特性研究[D].昆明：云南农业大学，2015.

[5]许强，袁乐梅，唐雪梅，等.川西彝族酸菜汁中抗氧化乳酸菌筛选及益生特性研究[J].中国调味品，2021，46（8）：60-64.

[6]邹建华，叶朋飞，毕润，等.散养茶花鸡源乳酸菌分离鉴定及益生特性研究[J].云南农业大学学报（自然科学），2018，33（4）：647-654.

[7]陈中爱，熊江，石庆楠，等.黔东南地区传统发酵白酸汤中乳酸菌的益生特性及应用[J].食品安全质量检测学报，2021，12（14）：5815-5821.

[8]ARAYA M，MORELLI L，REID G，et al.Probiotics in food. Health and nutritional properties and guidelines for evaluation[EB/OL].（2001-10-04）[2022-01-01].https：//xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show？paperid=8f2a968659893a1925a91e21a5e7330b&site=xueshu_se.

[9]DONG H，ROWLAND I，THOMAS L V，et al.Immunomodulatory effects of a probiotic drink containing Lactobacillus casei Shirota in healthy older volunteers[J].European Journal of Nutrition，2013，52（8）：1853-1863.

[10]WELMAN A D，MADDOX I S.Exopolysaccharides from lactic acid bacteria： perspectives and challenges[J].Trends in Biotechnology，2003，21（6）：269-274.

[11]王慧琳，周煒城，任聪，等.传统发酵食品微生物学研究进展[J].生物学杂志，2018，35（6）：1-5.

[12]武俊瑞.东北传统发酵特色食品中主要微生物多样性研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2013.

[13]龚加路，赵兴秀，邹伟，等.高产酸乳酸菌的分离鉴定及其益生特性的研究[J].中国调味品，2016，41（3）：17-20.

[14]李旭阳，刘慧燕，潘琳，等.宁夏自然发酵泡菜中乳酸菌的分离鉴定及其在枸杞汁发酵中的应用[J].食品工业科技，2021，42（23）：126-134.

[15]XU X，PENG Q，ZHANG Y，et al.Antibacterial potential of a novel Lactobacillus casei strain isolated from Chinese northeast sauerkraut and the antibiofilm activity of its exopolysaccharides[J].Food & Function，2020，11（5）：4697-4706.

基金项目：曲靖职业技术学院教科研课题（2020YJKT002）。

作者简介：叶朋飞（1992—），男，云南曲靖人，硕士，助教。研究方向：农产品加工及贮藏。