基于GC-IMS结合多元统计方法分析炸制时间对花椒调味油挥发性物质的影响

倪瑞洁，詹 萍,*，田洪磊,2,*

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119；2.石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）是芸香科花椒属植物，具有独特的香味和麻味，能够去腥、提香、增味、开胃，是“八大调味品”之一[1-2]。花椒油是花椒在烹饪中的传统应用形式之一，油炸后的花椒油比普通花椒油的风味透发性更强，更符合大众的口味。然而在油炸过程中，过长的油炸时间或过高的油炸温度会发生一系列复杂的反应，产生不良风味[3-4]，因此选择适当的炸制条件制备花椒调味油尤为重要。

目前，国内外针对花椒油的研究主要集中在花椒挥发油及浸提花椒油，关于花椒调味油的风味研究较少。Liu Yuping等[5]采用超临界二氧化碳萃取法制得花椒挥发油，用气相色谱-质谱联用嗅觉仪（gas chromatographymass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）分离鉴定出32 种气味活性化合物。牛文婧等[6]采用顶空-固相微萃取-GC-MS测定出7 个不同品种花椒油中的81 种香气物质。陈海涛等[7]采用香气稀释分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）法结合GC-MS-O分析发现芳樟醇、大根香叶烯D、柠檬烯、乙酸芳樟酯、乙酸-4-松油烯醇酯等是炸花椒油中的关键香气化合物。Sun Jie等[8]采用AEDA和GC-MS-O分析比较韩城花椒油和韩源花椒油的香气特征，发现β-水芹烯、对伞花烃、乙酸辛酯、辛醛、香茅醇和桧烯是引起差异的主要原因。上述研究在分离鉴定化合物时主要采用GC-MS，该技术灵敏度高、分离性能强、重复性好，是一种成熟的常规分析技术，但此技术无法分析鉴定出一些含量少而对风味至关重要的物质，且预处理步骤和质谱分析时间限制其应用[9-10]。

气相离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是近年来出现的一种新型气相分离检测技术，该技术结合GC的高分离能力和IMS的快速响应，具有响应快、灵敏度高、稳定性好等特点[11-12]。到目前为止，这项技术已经应用在食品分类和掺假[13-14]、异味检测[15]、加工过程的监控[16]以及贮存过程中香气变化的评估[17]等方面，而将GC-IMS用于花椒调味油挥发性化合物的分析研究鲜见报道。

本研究以花椒调味油为研究对象，采用电子鼻和GCIMS对不同炸制时间制得的花椒调味油进行挥发性成分及指纹图谱分析，结合主成分分析（principal component analysis，PCA）、判别因子分析（linear discriminant analysis，LDA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA），解析花椒调味油样品间挥发性组分差异，并筛选标志性化合物，以期对花椒调味油的风味组成进行探究，为花椒调味油的风味品质调控技术创制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大红袍花椒，产自陕西韩城（35°48′N，110°43′E），采购于当地农户；鲁花低芥酸特香菜籽油市购。

1.2 仪器与设备

iNose电子鼻 上海瑞玢国际贸易有限公司；Flavour Spec®GC-IMS联用仪 德国G.A.S公司；SE202F百分之一天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 河南予华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将花椒进行除杂筛选处理，准确称取150 g菜籽油倒入0.5 L圆底烧瓶中，在油浴中逐渐加热至130 ℃时控温，加入25 g干花椒颗粒进行恒温炸制，且炸制过程中不断搅拌混合物以防止局部过热。整个过程使用油温计测量温度，分别持续5、15、25 min和35 min后停止加热，自然冷却至室温，并去除花椒颗粒，单独盛取花椒调味油，冷藏待用。对制得的花椒调味油依次编号，分别为HPO1、HPO2、HPO3和HPO4。

1.3.2 感官评价

参考Sun Jie等[8]研究并调整：准确称取10 g花椒调味油于无嗅的透明PET瓶中（体积50 mL），在室温下由感官评价小组进行描述性感官评价分析（descriptive sensory analysis，DSA）。经3 轮培训和筛选后，感官评价小组由10 名成员（5 男，5 女，20～30 岁）组成。在培训期间，小组成员讨论并确定了样品的呈香属性及相对应的标准气味剂。呈香属性分别为草药味、柠檬香、青香、松木香、脂肪香和焦糊味。将这些呈香属性与下列标准气味剂水溶液进行比较：草药味（1,8-桉树脑）、柠檬香（柠檬烯）、青香（芳樟醇）、松木香（β-月桂烯）和脂肪香（(E)-2-庚醛），焦糊味呈现出令人不愉快的味道。各呈香属性以1为增量，在0（无臭味）～9 （极强气味）范围内进行评估。样品之间间隔1 min，所有样品进行3 次评估，结果取平均值。

1.3.3 电子鼻分析

电子鼻利用非特异的、灵敏的传感器阵列和模式识别系统，结合主成分分析（principal component analysis，PCA）、线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）等多元统计分析，反映样品的整体气味信息，能较好区分食品的品质差异[18-20]。分别准确称取7 g 花椒调味油于40 mL顶空瓶中密封，室温下平衡30 min。在分析样品之前，必须开机预热1 h，清洗仪器30 min，以纯空气作为载气清洗传感器阵列，使响应信号降为0。进样体积为1 000 μL，分析采样时间为120 s，样品之间清洗180 s。以上步骤均在室温下进行，每个样品测定5 次平行。

1.3.4 GC-IMS分析

顶空进样条件：准确称取1 g花椒调味油，装入20 mL顶空进样瓶中密封。50 ℃条件下孵育20 min，孵化转速500 r/min；进样针温度85 ℃；进样体积500 μL。

GC条件：FS-SE-54-CB-1非极性色谱柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）；柱温60 ℃；分析时间30 min；载气：N2（纯度≥99.999%）；载气流速：0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～10 mL/min；10～20 min，10～100 mL/min；20～30 min，100～150 mL/min。

IMS条件：漂移管长度5 cm；管内线性电压400 V/cm；漂移气：N2（纯度≥99.999%）；流速150 mL/min；IMS温度45 ℃。

1.4 数据处理

电子鼻数据利用内置的smartNose分析软件进行线性判别分析；利用GC-IMS一系列配套的分析软件（LAV（laboratory analytical viewer），Reporter插件、Gallery Plot插件和Dynamic PCA插件以及GC×IMS Library Search）对花椒调味油的挥发性香气物质进行数据采集和分析。采用IBM SPSS Statistics 25.0进行单因素方差分析（ANOVA），利用Duncan多重比较评定样品间的差异性，P≤0.05，认为数据具有统计学意义。采用Origin 2018对数据进行统计分析及制图。

2 结果与分析

2.1 花椒调味油感官评价分析

通过DSA对4 个样品（HPOs）的草药味、柠檬香、青香、松木香、脂肪香和焦糊味6 个呈香属性进行评价和比较，结果如图1所示。HPOs样品具有不同的香气强度，其中草药味、柠檬香、松木香和焦糊味存在高度显著差异（P＜0.001）。HPO1表现出最弱的草药味、柠檬香、松木香和焦糊味以及最强的脂肪香，可能是由于炸制时间较短（5 min）。随着炸制时间的延长，所有样品（HPO2～HPO4）的草药味、柠檬香、松木香均出现不同程度地增强，脂肪香逐渐减弱。而焦糊味在HPO4中最强烈，但在其他HPO样品中较弱，这表明当炸制时间超过35 min时，焦糊味会增强。同时HPO2是在中等炸制时间（15 min）下制备的样品，表现出最强的草药味、柠檬香和松木香，脂肪香和青香适中，有很弱的焦糊味，使HPO2的整体香味浓郁，清香独特，油腻感弱，最容易被小组成员接受。

2.2 花椒调味油电子鼻分析

为避免生理嗅觉的缺陷，增强对食品气味辨别的稳定性和重复性，采用电子鼻系统获取挥发性化合物整体轮廓，根据14 根传感器对样品的平均响应值建立雷达指纹图谱和传感器信号强度图[21]，比较4 个花椒调味油样品之间的差异。如图2a所示，花椒调味油风味差异主要集中在传感器0、1、7、11和12上，表明电子鼻对不同炸制时间的花椒调味油风味区分效果较好，尤其是在传感器7上，对花椒调味油的风味轮廓感知更敏感，区分效果最佳。

图2 电子鼻检测不同炸制时间的花椒调味油的风味雷达图（a）和LDA图（b）Fig. 2 Radar map (a) and LDA (b) plot of E-nose data of fried pepper oils with different frying times

LDA可用于确定HPOs之间存在可察觉的嗅觉差异，缩小同类数据的差异，扩大不同数据之间的差异，组间距离越大说明差异性越大[22]。如图2b可知，样品聚集明显，花椒调味油能很好地被区分。HPO1和HPO2主要集中在图上方，HPO3和HPO4主要集中在图下方。此外，图中各HPO的3 个平行之间的重复性也较好，无显著差异。根据LDA结果，在不同炸制时间下，HPOs的香气强度存在显著差异，可以用电子鼻有效识别，这些结果与DSA获得的结果一致。

2.3 花椒调味油的GC-IMS分析

2.3.1 不同炸制时间花椒调味油中挥发性化合物GCIMS分析

由Reporter插件生成不同炸制时间下花椒调味油中挥发性化合物的GC-IMS三维谱图。如图3a所示，不同炸制时间花椒调味油中的挥发性化合物种类相似，但峰值强度有所不同。随着炸制时间的延长，几乎没有新的化合物生成，仅出现含量的变化。

为进一步直观比较样品之间的差异，结合二维俯视图对样品的GC-IMS进行分析，如图3b所示。背景为蓝色，横坐标1.0处红色竖线为反应离子峰（reaction ion peak，RIP）。RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物。颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大。化合物主要集中在不同炸制时间之间A、B区域相比较，A区域中部分化合物颜色加深，B区域的化合物颜色变浅，说明随着炸制时间的延长，A区域的化合物含量增加，B区域的化合物含量降低。

图3 不同炸制时间花椒调味油中挥发性有机物的GC-IMS三维谱图（a）和二维谱图（b）Fig. 3 GC-IMS 3D (a) and 2D (b) topographic images of volatile compounds in fried pepper oils with different frying times

2.3.2 不同炸制时间花椒调味油中挥发性化合物定性分析

采用GC×IMS Library Search中内置的NIST数据库和IMS数据库，根据保留指数、保留时间和离子迁移时间对花椒调味油中挥发性化合物进行定性分析，结果如表1所示。部分挥发性化合物出现了二聚体甚至多聚体，它们具有相近的保留时间和不同的迁移时间，这是GC-MS联用仪所检测不出的[23]。在4 个样品中共鉴定出46 种挥发性化合物，包括醛类19 种、萜烯类15 种、醇类8 种、酯类3 种和酮类1 种。随着炸制时间的延长，挥发性有机物的种类没有发生变化，醇类、酯类含量均出现不同程度的先下降后上升趋势，萜烯类化合物含量变化不大。醛类化合物包括己醛、庚醛、(E)-2-庚醛等，这些化合物主要是脂质氧化的产物，与脂肪和油性风味有关，为花椒调味油的脂肪香提供较大的贡献；萜烯类化合物含量最高，包括β-蒎烯、α-蒎烯、柠檬烯、α-松油烯、β-罗勒烯等，赋予花椒调味油浓烈的青香、木香和薄荷香，是花椒调味油的主要呈香物质[8]；醇类化合物包括α-松油醇、芳樟醇、桉叶油醇等，主要赋予花椒调味油薄荷香、药草香和花香[7]；酯类和酮类化合物主要提供了果香，这些化合物共同构成了花椒调味油浓厚绵长的独特风味。

表1 不同炸制时间花椒调味油中的挥发性化合物Table 1 Volatile compounds in fried pepper oils with frying times identified by GC-IMS

续表1

2.3.3 不同炸制时间花椒调味油中挥发性化合物指纹图谱

采用仪器配套的Gallery Plot插件生成指纹图谱，可直观地呈现不同炸制时间花椒调味油之间的挥发性化合物差异。如图4a所示，同一行表示同一花椒调味油中的挥发性化合物的信号峰，同一列表示同一挥发性化合物在不同花椒调味油中的信号峰，整个指纹图谱可以呈现每种样品的完整挥发性有机物信息以及样品之间挥发性有机物的差异。颜色由浅到深表示挥发性化合物的含量由低到高。不同炸制时间的花椒调味油之间差异显著。红框中的物质随花椒炸制时间的延长含量呈上升趋势，包括(E)-2-庚醛、(E)-2-戊醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、乙酸异戊酯和乙醇等，多数为醛类。绿框中的物质随花椒调味油炸制时间延长含量呈先上升后下降趋势，包括α-萜品烯、水芹烯、4-萜烯醇、3-甲基丁酸乙酯和乙缩醛等。部分挥发性化合物在花椒调味油的4 个样品中含量均很高，包括β-蒎烯、α-蒎烯、β-罗勒烯、柠檬烯、芳樟醇、2-甲基丁醛等，与陈海涛等[7]的研究结果一致。柠檬烯与芳樟醇含量在一定程度上反映了花椒的品质和差异，对花椒调味油的风味也有一定的影响[24]。

利用LAV软件对4 个HPOs进行PCA。如图4b所示，根据PCA结果，2 个PC的贡献率（PC1为73%；PC2为8%）占方差的81%，能反映出样品的总体特征[25]。随着炸制时间的延长，代表花椒调味油的点在PCA图上呈现从左到右的规律排列。显然，每个样本都可以区别于其他样本，并且在得分图的不同区域有明显的聚类。HPO1和HPO2集中在图右侧，而HPO3和HPO4主要位于图左侧。花椒调味油（HPO1～HPO4）之间的差异主要集中在PC1。

图4 不同炸制时间花椒调味油中挥发性有机物的指纹图谱（a）及PCA图（b）Fig. 4 Fingerprint (a) and PCA plot (B) of volatile compounds in fried pepper oils with different frying times

2.3.4 不同炸制时间花椒调味油中挥发性化合物PLS-DA

PLS-DA是一种基于偏最小二乘回归算法的有监督的分析方法，能够对数据进行降维，实现复杂数据的可视化及判别分析和预测[26-27]。在PLS-DA中使用7 倍交叉验证预测残差方差分析和100 次随机重分类的响应置换评价模型的性能指标。交叉验证用于确定解释X方差、Y方差和交叉验证预测能力（Q2）的总数量所代表的足够PCs的数量[25]。其中，代表该模型较可靠。如图5a所示，所有的R2值和Q2值均是模拟值低于原始值，Q2的回归线截距为负值，上述结果说明该模型稳定性较好，未出现过拟合现象，具有较好的预测能力。

PLS-DA因子载荷图可直观地反映每一个变量在得分图上的贡献[28]，对不同炸制时间制得的花椒调味油中重要香气成分进行分析。如图5b所示，20（β-蒎烯）、36（萜品四醇）、32（α-蒎烯）、10（糠醛）、17（2-甲基丁醛）、42（1-丙醇）等物质是HPO1的特征性风味物质；24（柠檬烯）、28（α-水芹烯）、13（乙缩醛）、26（α-松油烯）、45（3-甲基丁酸乙酯）等物质是HPO2的特征香气物质，萜烯类物质多，柠檬香和松木香浓烈；HPO3的主要香气成分有19（2-丙烯醛）、38（1,8桉树脑）、34（α-蒎烯）、25（柠檬烯）、37（芳樟醇）等风味物质；HPO4的香气成分主要是醛类物质，包括1（己醛）、3（(E)-2-戊醛）、4（庚醛）、14（戊醛）、22（β-蒎烯）、44（3-甲基丁酸乙酯）等物质，由于炸制时间过长，脂肪氧化程度高，导致焦糊味明显增强，与DSA和指纹图谱结果一致。

变量投影重要性（variable important for the projection，VIP）可用于筛选对花椒调味油呈香轮廓有重要影响的关键标记物[29]。如图5c所示，20 种VIP值大于1的挥发性化合物在判别中具有重要作用，分别为芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、柠檬烯、α-水芹烯、己醛、庚醛、(E)-2-己醛、(E)-2-庚醛、糠醛、2-甲基丁醛、甲基丙醛、2-丙烯醛、1-丙醇和3-甲基丁酸乙酯，VIP值越大，差异越显著。在以上化合物中，有11 种醛类化合物和6 种萜烯类化合物，因此醛类和萜烯类对于花椒调味油整体风味的影响尤为关键。醛类化合物主要是由多不饱和三酰甘油热氧化产生[30-31]，氧化产物随炸制时间的延长而增多，如正己醛是亚油酸的关键氧化代谢产物，亚麻酸等不饱和脂肪酸在一定条件下可快速降解为2-己烯醛，并转化为正己醛[32]。单萜（β-蒎烯、α-蒎烯、柠檬烯、α-水芹烯）和含单萜的含氧化合物（芳樟醇）可能是在花椒内合成的，在炸制的过程中从花椒中浸出到油中。在生物合成中，首先生成主前体焦磷酸异戊烯酯（isopentenyl pyrophosphate，IPP），IPP被异构化为二甲基烯丙基焦磷酸酯（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），然后IPP和DMAPP单元缩合得到异戊烯基化的焦磷酸酯，这是不同萜类化合物的直接前体。IPP和DMAPP单元之间的缩合反应是由特定的戊烯基转移酶催化的[33-34]。如果缩合产物为香叶基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP），GPP在单萜合成酶作用下可转化为芳樟醇、柠檬烯和1,8-桉树醇；如果产物为二磷酸神经磷酸酯（neryl diphosphate，NPP），则NPP在单萜合成酶作用下转化为α-萜烯和水芹烯[35]。结合醛类和萜烯类化合物在炸制过程中的含量变化，选择炸制时间为15 min，与DSA结果一致。

图5 不同炸制时间花椒调味油中挥发性有机物的PLS-DAFig. 5 PLS-DA of volatile compounds in fried pepper oils with different frying times

3 结 论

本研究采用描述性感官分析、电子鼻和GC-IMS对不同炸制时间下花椒调味油的香气特征进行分析。结果表明在炸制15 min时，HPO2表现出最强的草药味、柠檬香和松木香，且焦糊味很弱，使HPO2的整体香味浓郁，清香独特，油腻感弱。在花椒调味油中共分离鉴定出46 种化合物，包括醛类19 种、萜烯类15 种、醇类8 种、酯类3 种和酮类化合物1 种。随着炸制时间的延长，4 个花椒调味油中的挥发性化合物种类相似，但峰值强度存在显著差异，其中醛类物质包括己醛、庚醛、(E)-2-庚醛等的含量呈现上升的趋势，α-萜品烯、水芹烯、4-萜烯醇、3-甲基丁酸乙酯和乙缩醛等的含量呈先上升后下降趋势，醇类、酯类含量随着炸制时间的延长先下降后上升，萜烯类化合物含量变化不大。通过PLS-DA共筛选出20 种标志性化合物，包括芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、柠檬烯、α-水芹烯、己醛、庚醛、(E)-2-己醛、(E)-2-庚醛、糠醛、2-甲基丁醛、甲基丙醛、2-丙烯醛、1-丙醇、3-甲基丁酸乙酯等。