雪菊精油对希氏肠球菌产酪胺及相关基因表达的影响

李亚倬，黄亚丽，于红红，王静云，卢士玲

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

酪胺是以酪氨酸为前体物质经脱羧后形成的一种血管活性生物胺（图1），广泛存在于奶酪、豆制品和发酵肉制品等食品中[1]。当体内酪胺含量过高或分解代谢受阻时，过量的酪胺进入血液，刺激交感神经系统兴奋，过度释放去甲肾上腺素，使大脑和心脏处于高压状态从而引发一系列的生理反应，包括头痛、偏头痛、发热、心悸、流涎、流泪等[2]。严重时甚至导致医疗并发症：心跳过快，外周血管收缩，心脏输血量增加，血压上升引发高血压。这可能对患有冠状动脉疾病或VB12缺乏的患者造成生命威胁[3]。美国食品药品监督管理局规定，鱼类中酪胺含量不得超过100 mg/kg[4]。总之，减少食物中酪胺的产生以避免酪胺的过量摄入至关重要。

图1 酪氨酸脱羧生成酪胺示意图Fig. 1 Decarboxylation of tyrosine into tyramine

研究学者已对不同微生物编码酪氨酸脱羧（tyrosine decarboxylase，TDC）途径的基因簇进行了充分研究。例如，肠球菌属[5-6]、短乳杆菌[7-8]、弯曲乳杆菌[9]、清酒乳杆菌[10]中均被证实酪氨酸脱羧酶基因主要由4 种基因组成，分别为编码酪氨酸脱羧酶的tyr DC[11]、编码酪氨酸/酪胺透性酶的tyr P、编码酪氨酰-tRNA合成酶的tyr S以及编码Na＋/H＋转运蛋白的nha C[12-15]。

雪菊（Coreopsis tinctoria）主要分布在新疆昆仑山，是一种可与雪莲相媲美的高山野生植物，具有抑菌、抗氧化、保护脏器、降糖、降脂、抗炎和抗癌等多种生理作用，有较高的药用价值[16-17]。雪菊精油的主要成分为D-柠檬烯（含量约50%～70%）和黄酮类化合物（总黄酮含量约15%～25%）[18-20]。雪菊精油具有较强的抗菌、抗氧化作用[21]，是一种天然抗菌剂，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌、新生隐球菌和金黄色葡萄球菌的生长有很强的抑制作用[22-23]。但对于雪菊精油是否对微生物产酪胺有抑制作用，以及是否影响TDC途径中相关基因表达还有待研究。本实验以高产酪胺的希氏肠球菌（Enterococcus hirae）为研究对象，探讨在纯菌体系和熏马肠中雪菊精油对希氏肠球菌抑菌能力、TDC途径中TDC基因簇相关基因表达水平和产酪胺量的影响，为雪菊精油在食品领域的应用开辟新的思路，同时为熏马肠中酪胺含量的控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌：希氏肠球菌N47，GenBank登录号为MT729969，从新疆熏马肠中分离保存，该工作在石河子大学食品学院完成。

马肉、天然动物肠衣 新疆伊犁市伊卡孜有限公司；食盐 福建泉州晶海轻化有限公司；味精、香料粉华星龙盛（厦门）食品有限公司；亚硝酸钠配料 四川金山制药有限公司；烟熏液 济南市历城区金牛山食品香料厂。

天山雪菊精油（100%纯单方） 霍城县五彩河谷农业开发有限公司；吐温80（化学纯）、环糊精（纯度≥99%） 天津福晨化学试剂厂；丹磺酰氯、酪胺标准品、L-酪氨酸、磷酸吡哆醛、乙腈（色谱纯） 美国Sigma公司；BHI培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；Trizol试剂（MagZolTMReagent）美国Invitrogen公司；5×All-In-One RT Master Mix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit) cDNA合成试剂盒、EvaGreen 2×qPCR MasterMix low ROX 加拿大Applied Biological Materials公司。

1.2 仪器与设备

ND2000C微量核酸测定仪 香港基因有限公司；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；UB-7型pH计 德国赛多利斯公司；5417R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；高速冷冻离心机美国贝克曼公司；多功能酶标仪 美国Bio-Tek仪器有限公司；M×3000P型实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）仪 美国安捷伦科技公司；ACQUITY Arc System高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Waters公司；T25 DS 25型匀浆机 德国IKA公司；SPX-150B-Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司；9020-0094 KBF 240型恒温恒湿培养箱 德国Binder公司。

1.3 方法

1.3.1 雪菊精油抑菌能力的测定

取在－18 ℃斜面保藏的希氏肠球菌N47接种在BHI液体培养液（pH 5.5）中，37 ℃培养24 h后，振荡菌液，使用灭菌金属接种环蘸取菌液划线于固体BHI平板培养基，37 ℃培养24 h后，挑取平板上单一菌落再次接种至BHI液体培养基中，完成3 次活化。使用0.85 g/100 mL无菌生理盐水稀释菌悬液至浓度为104～105CFU/mL，即菌悬液在600 nm处光密度约为0.3。参照于红红等[24]的方法采用双倍稀释法测定雪菊精油对供试菌最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）和最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.3.2 希氏肠球菌纯培养

准备5 个150 mL锥形瓶，分别加入含体积分数0.005%磷酸吡哆醛的BHI液体培养基100 mL。分为4 组：第1组仅添加体积分数0.5%酪氨酸（L）；第2组添加0.5%酪氨酸和1/2 MIC雪菊精油（1/2M）；第3组添加0.5%酪氨酸和MIC雪菊精油（M）；第4组为空白组，不添加酪氨酸和雪菊精油（K）。用不添加供试菌的阴性组作对照。雪菊精油用体积分数10%的吐温-80溶解：先将精油与吐温-80充分混匀，再边搅拌边加入蒸馏水。供试菌均按体积分数4%接种，于37 ℃恒温培养48 h。

1.3.3 雪菊精油对供试菌生长过程中pH值和OD600nm的影响

每隔4 h，用pH计测定1.3.2节所述4 组菌悬液pH值，用多功能酶标仪在波长600 nm处测定OD600nm，绘制希氏肠球菌在BHI培养基中培养48 h的生长曲线。

1.3.4 real-time PCR测定菌悬液TDC基因簇相关基因表达量

1.3.4.1 RNA的提取

为获得高质量的cDNA模板提取样本RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA。取1.3.2节生长至稳定期（24 h）的菌液2.0 mL，于4 ℃、1 000×g离心5 min，弃上清液；重复上述步骤3 次。采用Trizol法提取细菌总RNA，注意操作过程在冰上完成。根据MagZolTMReagent说明将所提RNA涡旋后，用无酶水校准微量核酸测定仪，吸取1 µL RNA样品于加样板，测定A260nm/A280nm、A260nm/A230nm和RNA浓度，检测RNA纯度。当A260nm/A280nm为1.9～2.1、A260nm/A230nm为1.8～2.5时，表明所提RNA纯度较高。取1 µL RNA上样于1%琼脂糖凝胶，5 V/cm电泳30 min。当凝胶电泳在28S、18S和5S处有清晰条带时，认为所提RNA具有良好的完整性。待RNA纯度以及完整性达到要求后，进行反转录。

1.3.4.2 cDNA的合成

为避免基因组DNA（gDNA）污染影响后续反转录实验，在合成cDNA前对RNA进行gDNA去除。按照cDNA合成试剂盒，2 μg RNA模板加入2 μL AccuRT Reaction Mix（4×），无酶水加至终体积为8 μL，室温下孵育5 min，然后加入2 μL AccuRT Reaction Stopper（5×），反应试剂充分混匀，以去除gDNA。然后加入4 μL 5×All-In-One RT MasterMix、6 μL无酶水，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育10 min终止反应，于冰上冷却，合成cDNA。合成的cDNA产物在－20 ℃冰箱中保存备用，作为下游的real-time PCR反应模板。所有反应在无酶环境中进行，并且始终将RNA置于冰上，防止RNA模板降解。

1.3.4.3 real-time PCR定量基因表达

按照EvaGreen 2×qPCR MasterMix试剂盒说明书步骤操作，real-time PCR反应体系（20 μL）：模板cDNA 2 μL、EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10.0 μL、上下游引物各0.6 μL、无酶水6.8 μL。引物见表1。real-time PCR试剂加入无酶八连管中，离心使反应液充分混匀后，立即进行real-time PCR。每组3 个平行。TDC基因簇基因相对表达量按2－ΔΔCt计算[25]。其中，ΔCt=Ct目的基因－Ct内参基因；ΔΔCt=ΔCt处理组－ΔCt空白组。Tyr DC、tyr P、tyr S以及nha C均以recA和tuf为内参基因，取均值。

表1real-time PCR所用引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.5 菌悬液中酪胺含量的测定

用0.4 mol/L高氯酸溶解10 mg酪胺标准品，并于5 mL棕色容量瓶中定容，分别稀释成终质量浓度为5、10、15、25、50、100、200 µg/mL的标准溶液。取1.3.2节供试菌液，培养48 h期间每隔4 h取样，12 000×g离心10 min，吸取1 mL上清液，加入相同体积0.4 mol/L高氯酸溶液，混匀，作为菌液样品处理液。

酪胺结构中缺少紫外检测器可检测到的发光基团，因此将酪胺提取液和衍生化试剂（丹磺酰氯）进行衍生化反应。取酪胺标准溶液与菌液样品处理液各1 mL，置于7 mL棕色样品瓶中，加入200 µL 2 mol/L NaOH溶液使溶液呈碱性，再加入300 µL饱和NaHCO3溶液进行缓冲，然后再加入2 mL 10 mg/mL 丹磺酰氯溶液（丙酮配制），振荡摇匀15 s，于40 ℃暗反应45 min后加入100 µL氨水，静置30 min，终止反应。用乙腈添加至终体积为5 mL，用0.22 µm滤膜过滤，待HPLC检测。

HPLC条件：色谱柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为超纯水，B为乙腈；流速0.8 mL/min；进样量5 µL；紫外检测波长254 nm；柱温30 ℃[29]。梯度洗脱程序为：0～5 min，35% A、65% B；5～24 min，0% A、100% B；24～25 min，35% A、65% B；25～30 min，B 65%。酪胺标准溶液不同质量浓度（x）与对应峰面积（y）作标准曲线，方程为y=2 945x＋2 398.9（R2=0.999 8）。根据回归方程计算菌液中的酪胺含量。

1.3.6 熏马肠的制备

按照Lu Shiling等[30]所述工艺制备4 组熏马肠：A组（不添加雪菊精油、不接种产胺菌）、B组（接种希氏肠球菌、不添加雪菊精油）、C组（接种希氏肠球菌、添加1/2 MIC雪菊精油）、D组（接种希氏肠球菌、添加MIC雪菊精油）。希氏肠球菌N47接种量均约为103CFU/mL。

原料马肉用绞肉机切成小块，按照瘦肉、肥肉质量比80∶20混合，向肉糜中添加辅料（2.5%食盐、0.1%味精、0.1%香料粉、2%白糖、0.005%亚硝酸钠配料和1%烟熏液，均为质量分数）腌制。按照分组添加（或不添加）不同质量浓度雪菊精油，以及接种（或不接种）希氏肠球菌。然后采用灌装机将不同处理组的混合肉糜灌入天然肠衣制成香肠。香肠在恒温恒湿培养箱中成熟程序进行发酵。

1.3.7 熏马肠pH值、细菌计数和酪胺含量的测定

在熏马肠发酵第0、2、7、14、21、28天分别采样进行测定。

称取5 g剪碎熏马肠肉糜，在90 mL蒸馏水中拍打6 min，在室温下用数字pH计测定pH值。

参考Sun Qinxiu[31]和Laranjo[32]等描述的平板计数法，测定熏马肠发酵过程中总需氧菌（total aerobic bacteria，TAB）、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）和肠细菌总数。

按照Lu Shiling等[30]的方法进行样品前处理，将5 g熏马肠样品在20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液中均质，提取液4 ℃、5 000×g离心10 min，重复上述步骤。收集25 mL上清液，并用0.4 mol/L高氯酸溶液添加至50 mL得到样品溶液。按照1.3.5节进行衍生化反应及酪胺含量HPLC定量测定。每组样品做3 个平行。

2 结果与分析

2.1 雪菊精油对希氏肠球菌N47的抑菌能力

雪菊精油对希氏肠球菌N47具有抑制作用，MIC和MBC分别为0.39 mg/mL和0.78 mg/mL。张艳梅等[23]探讨了昆仑雪菊挥发油对新生隐球菌抗菌能力，发现昆仑雪菊挥发油能够破坏新生隐球菌细胞膜达到抑菌效果，其对新生隐球菌的MIC为0.781 µL/mL。这一结果与本研究一致，均证明了雪菊精油的抑菌能力，但是本研究中雪菊精油对希氏肠球菌的MIC较低，这可能是由于菌体结构不同，导致希氏肠球菌对雪菊精油更为敏感。此外，迪里努尔·阿布都热合曼等[33]用体积分数95%乙醇溶液将雪菊树脂精油稀释至不同体积分数（1.563%～75%），用滤纸片法对雪菊树脂精油的抑菌能力进行测定，发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌、枯草杆菌、青霉和黑曲霉的MIC分别为体积分数25%、50%、75%、50%和75%。

2.2 雪菊精油对希氏肠球菌N47生长的影响

图2 雪菊精油对希氏肠球菌N47生长过程中OD600 nm的影响Fig. 2 Effect of C. tinctoria essential oil on OD600 nm during the growth of E. hirae N47

菌悬液OD600nm越大，表明细菌数量越多。如图2所示，添加雪菊精油的细菌OD600nm始终低于不添加雪菊精油组，说明雪菊精油能够抑制希氏肠球菌N47的生长，且雪菊精油添加量越大，其抑制作用越强。但是雪菊精油并没有改变其生长趋势，只是其生长周期相对延长。1/2 M和M组中，希氏肠球菌N47分别在培养28 h和32 h进入稳定期，生长量相对同一时间酪氨酸组（L组）分别下降了67.09%和75.43%。有研究发现，雪菊中的抑菌成分以黄酮类化合物为主，特别是多羟基结构的黄酮类化合物[34-35]。康宏玲等[22]通过微波辅助法提取昆仑雪菊中的总黄酮，测定雪菊总黄酮对细菌、霉菌及酵母菌的抑菌性能，发现雪菊总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、曲霉、酵母菌以及青霉的MIC分别为0.625、0.3125、0.3125、2.5、2.5、5.0 mg/mL。张艳梅等[23]对昆仑雪菊精油进行气相色谱-质谱分析，鉴定其主要抗菌组分是D-柠檬烯和α-蒎烯。这些抑菌成分会严重破坏新生隐球菌细胞膜，使核酸以及相关合成物质泄漏，削弱细胞活力，最终导致新生隐球菌死亡。此外，还有研究指出天然植物精油还可以通过影响微生物代谢相关基因的表达，致使菌体衰亡[36]。

2.3 雪菊精油对希氏肠球菌N47生长过程中pH值的影响

如图3所示，所有组pH值均在前16 h内呈上升趋势。这是由于产胺菌在对数期快速繁殖，酪氨酸在酪氨酸脱羧酶作用下形成酪胺，而呈碱性酪胺的大量产生使培养液pH值快速上升。这一结果和薛林林等[29]对粪肠球菌和屎肠球菌的研究结果不一致，可能是由于希氏肠球菌N47产酪胺能力更强，其产酪胺的速率远大于产有机酸的速率。Fernandez等[37]的研究结果也表明在氨基酸存在的情况下，产生物胺的细菌能够引起培养基pH值增加。1/2M、M组的最终pH值与L组相比均显著降低（P＜0.05），说明雪菊精油可以有效降低培养基pH值，从而抑制希氏肠球菌N47的生长。Wang Yongli等[38]发现绿茶精油和葡萄籽精油可以显著降低干腌腊肉的pH值。

图3 雪菊精油对希氏肠球菌N47生长过程中pH值的影响Fig. 3 Effect of C. tinctoria essential oil on pH during the growth of E. hirae N47

2.4 雪菊精油对希氏肠球菌N47 TDC基因表达的影响

图4 雪菊精油对希氏肠球菌N47 TDC相关基因表达量影响Fig. 4 Effect of C. tinctoria essential oil on the relative gene expression of tyrosine decarboxylase in E. hirae N47

如图4所示，相比空白组（K），添加酪氨酸（L）的希氏肠球菌N47中tyr DC、tyr P基因表达量均显著上调（P＜0.05），分别是K组的403.10 倍和795.11 倍。tyr DC和tyr P这两种基因的上调，是由于向反应体系中添加酪氨酸，为酪氨酸脱羧酶和酪氨酸/酪胺渗透酶提供了足够的前体物质。在酸性环境中，希氏肠球菌N47通过氨基酸脱羧反应产生碱性物质抵抗胞外的酸性环境。大量研究证明，氨基酸脱羧酶基因的表达需要酸性环境和高浓度的氨基酸底物[37]。在酪氨酸存在的情况下，添加MIC雪菊精油（M）的tyr DC和tyr P基因的表达量相比酪氨酸组（L）分别显著降低了99.45%和95.18%（P＜0.05）。有研究表明在酪胺形成机制中主要参与的基因是tyr DC和tyr P，这进一步表明雪菊精油可以通过影响酪氨酸脱羧酶和转运酪胺/酪氨酸蛋白的活性，减少相关基因表达量以及酪胺的积累[11]。这一结果和薛林林等[29]的研究结果一致，其发现阿魏酸可以显著抑制屎肠球菌和粪肠球菌中tyr DC、tyr P基因的表达，从而减少酪胺的产生[29]。

酪氨酸组（L）tyr S基因的表达显著低于不添加酪氨酸的K组（P＜0.05）。Linares等[39]得出类似结果，其研究显示杜兰氏肠球菌在酸性条件下，未添加酪氨酸时tyr S表达量最高，比酪氨酸诱导的mRNA表达水平高10 倍以上。酪氨酰-tRNA合成酶基因在酪氨酸不充足的条件下被激活，以防止这种氨基酸的大规模脱羧，确保其可用于蛋白质合成[39]。与酪氨酸组（L）相比，添加雪菊精油的希氏肠球菌N47中tyr S基因上调。这可能是由于精油组中希氏肠球菌N47的生长代谢受到抑制，生物活性减弱，使之利用培养基中酪氨酸能力降低，引发细胞的TDC基因簇遗传调控的负反馈调节机制[29]，触发tyr S基因转录，诱导酪氨酸合成相应的蛋白质维持自身的正常的生命活动。

相比L组，雪菊精油显著降低nha C基因的表达（P＜0.05），M组nha C基因表达量仅为酪氨酸组（L）的65.29%。关于产胺菌nha C基因在酪胺合成中的确切功能尚不明确，但可以确定雪菊精油能够抑制Na＋/H＋转运蛋白基因的表达。

2.5 雪菊精油对希氏肠球菌N47产酪胺含量的影响

图5 雪菊精油对希氏肠球菌培养48 h酪胺积累的影响Fig. 5 Effect of C. tinctoria essential oil on the accumulation of tyramine in E. hirae during 48 h cultivation

如图5所示，在仅添加酪氨酸情况下（L），希氏肠球菌N47产酪胺含量的变化趋势与其生长趋势一致。该菌在前12 h酪胺含量急剧增加，随后酪胺积累速度减慢，在24 h后含量逐渐趋于稳定，最终酪胺生成量最高达到189.84 μg/mL。显然，在酪氨酸含量充足的情况下，酪胺积累量和菌数呈正相关，添加酪氨酸可显著提高供试菌产酪胺量。由于培养基中营养物质有限，空白组（K）的酪胺终产量相对偏低。这说明希氏肠球菌N47产酪胺量依赖于外界环境中的营养物质总量。蛋白质丰富的食品更易出现生物胺超标这一食品安全问题。

不同质量浓度的雪菊精油对减少供试菌的酪胺产生量具有显著效果（P＜0.05），在添加1/2 MIC、MIC雪菊精油时，希氏肠球菌N47中培养48 h的酪胺最终生成量分别为35.62 μg/mL和17.84 μg/mL，较酪胺组（L）分别减少了81.24%和90.60%。这表明雪菊精油质量浓度越大，其酪胺积累量越低。结合2.2节和2.4节结果，雪菊精油不仅从源头抑制产胺菌的生长，还通过显著降低存活菌tyr DC、tyr P表达量，从细菌数量和基因表达上双重阻碍了酪胺的积累。大量研究表明，天然植物提取物能够抑制食品中生物胺的形成。Erol等[40]研究石榴籽提取物对谷物发酵食品Tarhana中生物胺形成的影响，发现添加0%、0.5%、1%、2%石榴籽提取物后，Tarhana中总生物胺含量分别为894.7、569.67、514.52、424.60 mg/kg。Martín等[41]研究百里香精油和牛至精油对真空包装鲤鱼鱼片中生物胺形成的影响，证实了这两种精油均能显著抑制腐胺、尸胺、酪胺和苯乙胺在鱼片中的积累。

2.6 雪菊精油对熏马肠发酵过程中pH值的影响

图6 雪菊精油对新疆熏马香肠发酵过程中pH值的影响Fig. 6 Effect of C. tinctoria essential oil on pH of Xinjiang smoked horse sausage during fermentation

如图6所示，所有香肠的pH值均在前7 d呈下降趋势，这是由于熏马肠中乳酸菌在发酵过程中代谢产生有机酸，使得熏马肠的pH值降低[42]。发酵7～28 d，pH值缓慢上升，这可能是由于碱性化合物的积累，如胺、肽和氨基酸[43]。在发酵后期（21～28 d），添加1/2 MIC（C）和MIC雪菊精油（D）的熏马肠pH值均显著低于对照组（B）（P＜0.05）。大量研究发现，添加植物提取物，如葱[44]、栗子、绿茶、葡萄、海藻[45]和石榴籽[40]的提取物可有效降低发酵食品pH值。pH值的降低对于提高发酵肉制品所需颜色的转化率、抑制有害细菌的生长以及减少发酵肉制品中不良风味的形成至关重要[38]。

2.7 熏马肠发酵过程中微生物菌落总数变化

表2 雪菊精油对新疆熏马肠发酵过程中TAB、LAB和肠细菌数量的影响Table 2 Effect of C. tinctoria essential oil on total aerobic bacterial count, lactic acid bacterial count, and Enterobacteriaceae count in Xinjiang smoked horse sausages during fermentation lg（CFU/g）

如表2所示，在整个发酵过程中，A、B、C和D组总TAB总数均呈先上升后下降的趋势，A、C和D组均在发酵第7天达到最大值，第28天分别降至6.77、7.59、6.17、5.82（lg（CFU/g））。可见，雪菊精油对熏马肠中细菌的生长有显著抑制作用（P＜0.05）[38]。Sun Qinxiu等[46]发现添加香料提取物（肉桂、茴香和丁香）的哈尔滨干香肠中需氧细菌总数较低（P＜0.05）。

在熏马肠整个发酵过程中，乳酸菌的变化趋势与TAB类似。LAB在发酵初期急剧增加，成为主要微生物，不仅促进了风味物质的形成，而且加速了熏香肠体系pH值的下降。LAB在发酵后期数量减少，这可能是由于熏马肠中低水分含量、低pH值以及代谢产物积累等不利条件。在发酵结束时，B、C、D组熏马肠中乳酸菌含量无显著差异（P＞0.05），这表明雪菊精油对LAB的抑制作用不强。这与Yu Honghong的研究结果类似[47]。

与对照组（B）相比，C组和D组熏马肠中的肠细菌数量均显著减少（P＜0.05），说明雪菊精油对肠细菌有较强的抑制作用，这与Sun Qinxiu等[46]报道的结果一致。再次证明植物精油可以作为合成抑菌剂的替代品添加至传统发酵肉制品中，以提高食品的安全性。

2.8 熏马肠发酵过程中的酪胺积累量分析

图7 雪菊精油对新疆熏马肠发酵过程中酪胺积累的影响Fig. 7 Effect of C. tinctoria essential oil on tyramine accumulation in Xinjiang smoked horse sausage during fermentation

如图7所示，未添加雪菊精油的熏马肠样品中酪胺含量在前14 d均显著上升（P＜0.05），这与香肠中产酪胺菌的快速增殖有关；发酵第14～28天缓慢上升可能是由于香肠pH值和水分含量降低，不利于微生物的生长。对照组（B）、1/2 MIC（C）和MIC雪菊精油组（D）的初始酪胺含量均值为2.07 mg/kg，在第28天时酪胺含量分别增加到222.57、78.52 mg/kg和45.83 mg/kg。第28天时1/2 MIC组和MIC组熏马肠中酪胺含量分别较对照组（B）降低了64.72%和79.41%，表明雪菊精油能够显著抑制熏马肠中酪胺的积累，且雪菊精油质量浓度越大抑制能力越强（P＜0.05）。与此结果一致，Cai Luyun等[48]发现添加丁香、孜然和留兰香精油可以有效抑制发酵凤尾鱼中生物胺的积累。

3 结 论

在纯菌培养体系中，雪菊精油能够显著抑制希氏肠球菌的生长并降低培养液pH值，且雪菊精油质量浓度越高，作用越强。雪菊精油能显著抑制TDC基因簇中tyr DC、tyr P基因的表达（P＜0.05），从而抑制TDC途径，降低酪胺积累量。雪菊精油通过抑制希氏肠球菌的生长和tyr DC、tyr P的表达，双重阻碍酪胺的积累。当添加MIC雪菊精油时，希氏肠球菌N47的酪胺生成量较酪氨酸组（L）减少了90.60%。在熏马肠体系中，添加雪菊精油抑制了不良肠细菌的滋生，降低了产品pH值，降低了酪胺积累量。1/2 MIC和MIC雪菊精油组熏马肠相比于对照组（B）酪胺积累量分别减少了64.72%和79.41%。总之，雪菊精油能有效抑制酪胺的形成，提高新疆熏马肠的产品安全性。