大豆蛋白肽聚集体与EGCG复合纳米颗粒及其乳液特性

董亚博，兰 天，付元涛，孙书境，李 萌，江连洲，隋晓楠，张 妍,2,*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺园林学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

酶水解大豆蛋白不仅具备丰富的营养价值还具备多种生物活性[1]。Zhang Lei等[2]研究表明大豆蛋白的特异性水解产物具有清除自由基和过渡金属螯合活性。同时García-Nebot等[3]还发现大豆蛋白的一种水解肽对亚油酸的过氧化进程有抑制作用。此外，从大豆蛋白中提取的多肽还具有降低胆固醇和体脂、预防骨质疏松、抑制血管紧张素I转换酶和抗高血压等多种对健康有益的特性[4]。然而，在大豆蛋白水解过程中，由于疏水性氨基酸或疏水性蛋白的暴露，会不可避免地发生肽-肽聚集或蛋白-肽的相互作用，从而形成不溶性肽聚集体[5]。这些不理想的聚集体质量可达总质量的40%，显著降低肽的可提取性和提取率。此外，这些聚集体通常被丢弃或用作动物饲料的原料，从而大大降低大豆蛋白的利用率，也增加对环境的不利影响。

(－)-表没食子儿茶素没食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）作为一种只存在于茶中的天然儿茶素（其他儿茶素也存在于水果和蔬菜中），通常被作为绿茶产品的质量指标[6]。EGCG是一种强大的抗氧化剂，可以保护食物和生物体免受自由基介导的氧化损伤。此外，蛋白质与多酚之间的相互作用也会通过修饰蛋白质分子影响其生理活性。已有研究[7]证明儿茶素与大豆蛋白的结合会引起蛋白结构和功能的变化。研究[8]表明EGCG与β-乳球蛋白通过疏水相互作用和氢键改变蛋白质二级结构，形成更加稳固的结构。在碱性条件下（pH 9.0），茶多酚与大豆蛋白的共价相互作用使蛋白质粒径变大，疏水性降低，显著提高蛋白质的乳化能力和乳液稳定性[9]。Kerckhoffs等[1]研究发现，经EGCG修饰后，大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）结构变得松散，暴露出更多的活性基团，从而使其发泡、乳化和抗氧化性能得到改善。

尽管已有研究表明大豆蛋白肽聚集体（soybean peptide aggregates，SPA）具有作为一种优良的乳液稳定剂的潜力[10]，但目前获得的信息仍然非常有限。因此，本研究试图通过与EGCG复合进一步改善SPA的理化特性，提高大豆蛋白的水解利用率，达到大豆蛋白的高值化利用，以期减少酶解废弃物对环境的影响，并为SPA在食品工业中的进一步应用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPI由实验室自制；葵花籽油 市购；EGCG（纯度98%） 西安通泽生物技术公司；碱性蛋白酶2.4 L（2.4 AU/g） 诺维信（中国）生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Mastersizer 2000激光粒度仪 英国马尔文仪器有限公司；Microfuge 20R冷冻离心机 美国贝克曼公司；数显恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；X’pert PRO衍射仪 荷兰PANalytical公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制备

参考Zhang Qiaozhi等[11]的方法稍加修改。大豆磨粉过筛，与正己烷混合3 次脱脂得到脱脂豆粉。将脱脂豆粉溶于去离子水中，并用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至8.0，45 ℃连续搅拌2 h后，6 000×g离心30 min后收集上清液，用2 mol/L HCl溶液调节上清液pH值至4.5以沉淀蛋白质，6 500×g离心20 min收集沉淀。将得到的沉淀用去离子水洗3 次，并用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至中性，冷冻干燥，得到SPI粉末。

1.3.2 SPA的制备

以SPI为原料，采用酶解法制备SPA。将冻干SPI与去离子水混合使其质量浓度为4 g/100 mL。然后加入1 g/100 mL碱性蛋白酶，并用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至8.5，温度保持50 ℃，反应3 h。反应结束后，将溶液加热到85 ℃并保持10 min，然后置于冰水中冷却降至室温，使碱性蛋白酶灭活终止反应。随后，用2 mol/L HCl溶液中和，调节pH值至7.0，并于8 000×g离心20 min，分离不溶性蛋白聚集物即为SPA。

1.3.3 纳米颗粒的制备

参照Liu Fu等[12]的方法稍作修改进行纳米颗粒的制备。将冻干SPA粉末分散于去离子水中，连续搅拌2 h，配制质量浓度为10 mg/mL的SPA分散液，4 ℃过夜，以确保完全水化。将EGCG粉末按冻干SPA粉末质量的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%加入SPA分散液中，室温下避光搅拌2 h得到SPA-EGCG复合物溶液。取不同添加比例的SPA-EGCG复合物溶液各30 mL进行超声（900 W、25 kHz）处理10 min，得到SPA-EGCG纳米颗粒（SPA-EGCG nanoparticles，ESNPs）。以未加入EGCG的纳米颗粒（SNPs）为对照。ESNPs和SNPs以液体形式或冻干保存在4 ℃冰箱中，用于特性分析。

1.3.4 纳米颗粒粒径的测定

参考鞠梦楠等[13]的方法，测定前用pH 7.0、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）将质量浓度10 mg/mL的SPA、SNPs和ESNPs分散液稀释100 倍，以避免聚集。

1.3.5 纳米颗粒Zeta电位的测定

参考Tao Fei等[14]的方法，为避免颗粒聚集影响测定结果，用pH 7.0、0.01 mol/L PBS将10 mg/mL 的SPA、SNPs和ESNPs分散液稀释1 000 倍，过0.45 μm水系膜后进行Zeta电位测定。

1.3.6 纳米颗粒荧光光谱测定

根据Zhang Nanhai等[15]的方法，将10 mg/mL的SPA、SNPs和ESNPs分散液用10 mol/L PBS在室温下稀释100 倍。用荧光分光光度计测定荧光光谱。发射光谱范围300～500 nm，激发波长280 nm。

1.3.7 纳米颗粒X射线衍射的测定

利用X’pert PRO衍射仪，设置参数为电流40 A，电压40 kV。Cu Kα X射线波长为0.1541 8 nm。在2θ4～75°、扫描速率0.056 °/s条件下捕获X射线衍射图。

1.3.8 乳液制备

参照Yang Han等[16]的方法加以修改。将40 mg/mL的SPA、SNPs和ESNPs分散液与葵花籽油混合，油相体积分数（φ）40%～60%，总体积20 mL。使用均质机于12 000 r/min均质2 min，制得乳液。

1.3.9 乳化性及乳化稳定性测定

根据You Yaohui等[17]的方法，将新制乳液用0.1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液稀释100 倍。使用紫外分光光度计测定，并以相同浓度SDS溶液调零。混匀后立即读取样品在500 nm波长处吸光度（A0）。放置10 min后，记录相同波长下吸光度（A10）。乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI）分别按式（1）、（2）计算：

式中：n为样品稀释倍数100；ρ为纳米颗粒质量浓度/（g/mL）；φ为油相体积分数/%。

1.3.10 乳液粒径测定

参照1.3.3节方法进行。

1.3.11 乳液初级氧化产物测定

按照Shantha等[18]所述方法测定初级氧化产物脂质过氧化值（peroxide values，POV）。将乳液倒入玻璃小瓶在60 ℃条件下加速氧化7 d，每天取样评估乳液的氧化稳定性。将15 mL醋酸-氯仿（3∶1，V/V）与0.3 mL乳液充分混合，涡旋振荡10 s后，2 000×g离心10 min，取上清液0.2 mL与2.8 mL甲醇-正丁醇（2∶1，V/V）、15 μL 3.9 mol/L硫氰酸钾溶液和15 μL 0.072 mol/L Fe2＋溶液充分混合，于室温下暗反应20 min。使用紫外分光光度计测定510 nm波长处吸光度，甲醇-丁醇（2∶1，V/V）作空白。以苯氢过氧化物为标准品，绘制标准曲线，根据曲线方程y=8.472x－0.070 9（R²=0.997 9）计算样品POV。

1.3.12 乳液次级氧化产物的测定

参照Yang Jiayi等[19]的方法并稍作修改。用少量2 mol/L NaOH溶液溶解三氯乙酸后，再用去离子水稀释，配制10 g/100 mL三氯乙酸溶液；然后用10 g/100 mL三氯乙酸溶液配制1 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液。将1.0 mL乳液样品与5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液和2 mL 1 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液混合，煮沸30 min，冷却至室温。将混合溶液与氯仿按体积比1∶3混合，4 000×g离心15 min，取上清液，用酶标仪测定532 nm波长处吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷为标准品，绘制标准曲线，根据曲线方程y=7.734 4x＋0.032 9（R2=0.998 3）计算样品丙二醛含量。

1.3.13 乳液光学显微镜观察

用pH 7.0、0.01 mol/L PBS将1 mL乳液样品稀释10 倍，取10 μL稀释后乳液滴于载玻片上，用盖玻片固定，采用正置显微成像系统观察乳液。

1.4 数据统计及分析

2 结果与分析

2.1 纳米颗粒粒径

图1 纳米颗粒粒径分布Fig. 1 Particle size distribution of nanoparticles

由图1可知，SPA分散液有2 个明显的峰，分别位于442 nm和955 nm处，经超声处理后生成的SNPs粒径特征峰左移至142 nm附近，表明超声作用有效地减小了蛋白质颗粒的粒径。超声波减小蛋白质颗粒粒径的作用已得到广泛报道，如向日葵分离蛋白颗粒[20]和乳清蛋白[21]在超声作用后颗粒粒径减小。超声波能有效分解团聚体和聚集体，并通过破坏非共价相互作用减小颗粒粒径[22]。Shanmugam等[23]报道，超声空化效应能够减小蛋白质颗粒大小，从而提高其溶解性。当EGCG添加量增加到2%时，ESNPs的粒径减小到58.8 nm，表明在SPA中添加EGCG可以促进超声后更小颗粒的形成。而EGCG能与食物蛋白相互作用形成大聚集体。Zagury等[24]研究发现，在EGCG存在的情况下，β-乳球蛋白颗粒粒径至少增大3～4 倍。据报道EGCG与大豆蛋白之间的主要作用力是疏水相互作用[25]，而超声处理会使蛋白质结构展开，暴露出更多的疏水残基[26]，这些暴露的残基促进蛋白之间的疏水相互作用，从而有助于蛋白质聚集体的形成。此外，Lum等[27]报道称疏水残基在形成团簇前需排出水分子。同时，EGCG分子具有将水分子从蛋白质表面排出的能力[28]。EGCG可能通过驱逐水分子促进相邻解折叠蛋白之间的疏水相互作用，从而降低蛋白质聚集的活化能垒。然而蛋白质快速聚集后，疏水残基定向形成致密的结构，抵抗进一步的聚集。本研究旨在分析EGCG和超声在减少蛋白质聚集物粒径大小方面的协同效应，并且Yang Han等[16]报道，粒径较小的蛋白颗粒能够在油-水界面迅速吸附到油滴上，从而增加乳液液滴的比表面积，形成更稳定的乳液。EGCG添加量0.8%的ESNPs粒径最小（50.7 nm），选择EGCG添加量0.8%的ESNPs制备乳液。

2.2 纳米颗粒Zeta电位分析

图2 纳米颗粒Zeta电位Fig. 2 Zeta potential of nanoparticles

从图2可以看出，所有样品Zeta电位均为负值，即带负电氨基酸的数量多于带正电氨基酸。与SPA相比，SNPs和ESNPs的Zeta电位绝对值有所增加，这是由于超声处理使蛋白空间结构发生变化，增加了蛋白质表面阴离子基团的暴露。中、高功率下超声处理可能会增加蛋白质表面电荷，提高蛋白颗粒间的静电斥力，阻碍聚合，增强蛋白分散体系稳定性，从而提高SNPs和ESNPs的溶解度[29]。此外，随着EGCG添加量的增加，ESNPs的Zeta电位绝对值增大，在EGCG添加量0.8%达到最大（由17.0增加至34.12），这归因于带负电荷的EGCG与蛋白的结合。当Zeta电位绝对值增大，离子间的静电斥力增大，体系相对稳定，使蛋白以小颗粒形式分散，这与粒径结果一致。此外，Zeta电位绝对值的增大也可能是由于EGCG与蛋白复合降低了蛋白等电点[30]。相似地，Wei Zihao等[31]研究表明，EGCG与牛乳蛋白共价结合，偶联物Zeta电位绝对值较牛乳蛋白有所增加。

2.3 纳米颗粒的荧光光谱分析

如图3所示，与SPA对比，SNPs荧光强度显著提高，这说明超声处理可引起一定程度的蛋白分子结构展开，从而增加暴露于外部环境的荧光基团数量[26]。这种现象主要是由空化效应引起的流体混合和强剪切力造成的[32]。这与Jambrak等[33]对乳清蛋白的研究结果相似，其发现超声波处理可以使蛋白分子结构展开，破坏蛋白质分子内疏水键，诱导更多蛋白分子内的色氨酸残基暴露。超声和EGCG联合处理后，ESNPs的荧光强度随EGCG添加量的增加而降低。同样地，当其他分子如花青素-3-葡萄糖苷与大豆蛋白相互作用时，也观察到蛋白内源性荧光强度的剂量依赖性猝灭[34]。ESNPs荧光强度的降低可能是分子内相互作用（如氢键）导致蛋白质结构紧缩造成[35]。此外，超声波高剪切作用使蛋白结构部分展开，也使EGCG很容易进入蛋白分子内部与荧光基团作用，导致荧光猝灭[36]。

图3 纳米颗粒荧光光谱Fig. 3 Fluorescence spectra of nanoparticles

2.4 纳米颗粒的X射线衍射分析

图4 纳米颗粒X射线衍射图谱Fig. 4 X-ray diffraction patterns of nanoparticles

如图4所示，所有样品均在2θ10°和22°附近表现出强烈的特征衍射峰，这与Chen Jun等[37]对SPI的研究结果一致。SNPs和ESNPs的特征衍射峰强度明显低于SPA，这说明SNPs和ESNPs的结晶度有所降低。Zhang Yuanhong等[38]也报道了类似的结果，他们观察到负载姜黄素的大豆蛋白肽纳米颗粒的结晶程度明显降低。与EGCG络合后蛋白结晶度的降低表明蛋白从晶体结构转变为非晶态结构。此外，据报道蛋白在2θ约22°处的衍射峰强度能够代表β-折叠结构的含量[37]。SNPs和ESNPs在2θ约22°的衍射峰强度降低，表明其β-折叠结构含量较SPA降低，这与Zhou Siduo等[39]报道的添加EGCG后SPIβ-折叠含量减少的结果一致。

2.5 乳液粒径分析

图5 不同油相体积分数乳液（40 mg/mL）的粒径Fig. 5 Particle sizes of emulsions with different oil phase volume fractions

由图5可知，乳液颗粒质量浓度40 mg/mL，不同油相体积分数的ESNPs乳液平均粒径均小于SPA和SNPs乳液。这说明ESNPs乳液与其他2 种乳液相比更加稳定，EGCG与超声共同作用制备的纳米颗粒可以明显改善乳液的稳定性。这一结果也与纳米颗粒的粒径结果一致。Karnaukhova等[40]研究表明，添加适量的小分子物质可以显著改善大分子蛋白乳液的液滴粒径。Li Dan等[41]研究表明，儿茶素的加入有效改善了EGCG-米糠蛋白复合物乳液粒径，明显小于米糠蛋白乳液。此外，随着油相体积分数的增加，乳液液滴粒径增大，最高达到13.6 μm（油相体积分数60% SPA组），这可能是由于一定质量浓度的纳米粒子只能稳定有限的油-水界面。随着油相体积分数的增加，需要在较小的总界面面积下形成较大的液滴，以实现所有油滴表面的充分覆盖[16]。

2.6 乳液的乳化性和乳化稳定性分析

图6 乳液（40 mg/mL）的乳化性及乳化稳定性Fig. 6 Emulsifying activity index and emulsion stability index of emulsions

如图6所示，SPA乳液EAI为（46.6±4.27）m2/g，超声处理后，SNPs乳液EAI显著增加至（93.5±1.65）m2/g（P＜0.05），表明超声处理促进了蛋白与油脂或蛋白与蛋白之间的相互作用。与SPA乳液相比，超声处理使SNPs和ESNPs乳液的ESI分别增长至约2 倍和3 倍，说明超声处理可提高乳液稳定性。这与Shen Xue等[42]的研究结果一致，他们发现超声处理提高了乳清蛋白的ESI。Amiri等[43]发现不同超声功率（100～300 W）处理30 min后，牛肉肌原纤维蛋白的EAI和ESI均有所提高。ESNPs乳液的EAI和ESI均高于SPA和SNPs乳液，说明EGCG的加入和超声联合处理有助于提高SPA的乳化能力。Yan Shizhang等[44]研究表明经EGCG共价改性后，SPI乳化性能得到明显改善。

2.7 乳液的氧化稳定性分析

图7 乳液（40 mg/mL）的POV（A）和丙二醛浓度（B）Fig. 7 Changes in peroxide value and malondialdehydem concentration of emulsions as a function of storage time

由图7可知，质量浓度40 mg/mL、油相体积分数60%的SPA、SNPs、ESNPs乳液于60 ℃贮藏7 d后，3 种乳液POV均随贮藏时间的延长而增加，与SPA乳液相比，贮藏期间SNPs和ESNPs稳定乳液POV显著较低（P＜0.05），表明它们的氧化速率较慢。与初级氧化结果一致，贮藏期间SPA稳定乳液的丙二醛浓度迅速增加，第7天时丙二醛浓度较初始水平增加了14 倍。与SPA乳液相比，ESNPs稳定乳液的丙二醛浓度在整个贮藏期都较低，且增加较为缓慢，表明EGCG结合超声处理抑制了油脂氧化，仅超声处理的SNPs乳液的丙二醛含量虽然也低于SPA乳液，但其脂质氧化的抑制效果不如ESNPs乳液。EGCG与SPA结合可以清除自由基或使促氧化剂（如油-水界面的过渡金属离子）失活，从而阻止脂质分解为烷氧基和过氧自由基[45]。此外，这些高活性的自由基与不饱和脂肪酸中的氢结合使其活性受到抑制，从而延缓脂质的氧化[46]。此外，有研究[47]表明乳液的氧化稳定性与颗粒大小密切相关。因此，SPA乳液对脂质氧化的敏感性较SNPs和ESNPs高，这很大程度归因于SPA颗粒粒径更大、更不均匀。同时，ESNPs构成致密的界面膜阻止促氧化剂的渗透和扩散，延缓了脂质与促氧化剂的相互接触，从而有效抵抗脂质的次级氧化。Phoon等[48]也认为，交联的界面蛋白层可能是阻止氧分子转移的有效物理屏障，从而抑制了油脂氧化。Fan Yuting等[49]研究发现，乳球蛋白-EGCG共轭物有助于提高包封油脂或保健食品的氧化稳定性。总之，EGCG结合超声处理的ESNPs不仅显著改善了乳液的物理稳定性，而且阻碍了油脂氧化。

3 结 论

与SPA相比，SNPs和ESNPs粒径减小，随EGCG添加量的增加，ESNPs粒径分布向左侧移动，Zeta电位绝对值先增大后趋于平缓。EGCG添加量0.80%的ESNPs粒径最小、Zeta电位绝对值最大。荧光光谱显示，与SPA相比，SNPs荧光强度增强，而ESNPs荧光强度减弱，且呈EGCG剂量依赖性猝灭。X射线衍射图显示，SPA、SNPs和ESNPs均在2θ10°和22°附近有特征衍射峰，表明SNPs和ESNPs的结晶度较SPA降低，由晶态向非晶态转变。此外，随油相体积分数的增加，SPA、SNPs、ESNPs乳液粒径均逐渐增大。SPA乳液粒径最大，其次是SNPs，ESNPs乳液粒径最小。氧化稳定性结果显示，ESNPs乳液的脂质氧化分解被有效抑制，初级氧化产物和次级氧化产物含量均少于SPA和SNPs乳液。基于这些结果，ESNPs具有作为优异乳液稳定剂的潜力。