生物有机肥中主菌LBI-1的室内筛选

李丽丽

（辽宁微科生物工程有限公司，辽宁朝阳 122000）

近年来，微生物肥料在肥料市场广受大家关注。其主要原因是为满足人们购买绿色食品的需要，首要任务是维持土壤生物肥力，这其中微生物作为不可缺少的一份子，起到了至关重要的作用。微生物肥料的核心是功能微生物，决定微生物肥料功能的主要是其中含有的功能微生物的种类和数量。微生物间有着互利共栖、互惠共生、协同共栖、偏离共生等关系，可利用这些关系提高活性代谢产物产量或诱导新活性物质的产生，应用于新产品研发[1]。新型的植物防治方法着眼于生物防治，由于其副作用小且有效期长受到广泛关注[2]。微生物放线菌代谢产物对植物病原菌有抑制作用，定植在植株根部会产生有益菌群[3-7]，使植株得病率降低，健康成长的同时达到高产目的。

放线菌微生物肥料，是主要利用放线菌的活菌或其生命活动促使农作物得到特定肥料效应的一种生物制品，对农业有着重要的作用，不仅体现在能改善土壤养分的供应情况，还体现在对作物生长的促进、抗病、抗逆性等多个方面[8-12]。基于此，本文研究了放线菌对土壤病原菌的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株

（1）放线菌

LB-1（CK）、LB-2、M-4、LB-8、LB-9、LBM-7、M-8、M-9和LBI-1由辽宁微科生物工程股份有限公司技控中心菌种库提供；金黄色链霉菌（41556）从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买。

（2）植物病原菌

禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）、串珠镰刀菌（Fusariummoniliforme）、人参菌核病（Sclerotinia schinseng）、烟草赤星病（Alternaria alternata）均由辽宁省微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 试剂与仪器

液体发酵培养基：淀粉0.5%，葡萄糖0.5%，豆饼粉1.5%，玉米浆1.4%，硫酸铵0.2%，磷酸氢二钾0.005%，硫酸镁0.015%，氯化钠0.1%，轻质碳酸钙0.3%，蒸馏水1 L，pH 7.2。灌装在500 mL三角瓶里，每瓶装量约100 mL，用纱布、牛皮纸包扎好后，121 ℃、0.1 MPa灭菌30 min，备用。

高氏培养基和PDA培养基按照文献[3]的方法制备。

LX-B75L立式自动电热压机蒸汽灭菌锅，合肥泰华医疗设备有限公司；SGSP-02电热恒温隔水式培养箱，湖北省黄石万丰医疗器械有限公司；HYC-260医用冷藏箱，青岛海尔特种电器有限公司；FA2104A电子天平，上海精密科学有限公司。

淀粉，食品级，秦皇岛骊骅淀粉有限公司；葡萄糖，食品级，嘉吉生化有限公司；豆饼粉，食品级自产；玉米浆，工业级锦州元成生化科技有限公司；硫酸铵，工业级，鞍钢股份有限公司；磷酸氢二钾，工业级，山东振华工业股份有限公司；硫酸镁，工业级，营口复兴矿物质有限公司；氯化钠，工业级，大连盐业集团有限公司；轻质碳酸钙，工业级，平安县关都碳酸钙有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种初筛

利用对峙培养法[5]，通过10株放线菌对5种病原菌的抑制效果进行初筛。

将培养好的病原菌用打孔器接种于PDA平板中心位置，28 ℃培养1 d后，在距离菌饼四周同等距离处接种放线菌菌饼，菌苔朝下。每皿4种放线菌，每处理3个平行，28 ℃培养7 d后观察结果。根据抑菌圈有无及其大小，初步筛选对病原菌具有拮抗作用的放线菌。

1.2.2 复筛

采用对峙培养法、杯碟法[6]两种方法进行放线菌抑菌活性测定。选择初筛实验中对病原菌有较好抑制效果的放线菌，取适量接种于发酵培养基中进行液体培养，培养条件28 ℃，160 r/min，88～112 h后得到过滤液，备用。同时以放线菌LB-1做对照。

用无菌打孔器制作上述5种病原菌菌饼，将菌饼接种于PDA平板中心位置上，28 ℃培养2 d。距菌饼周围同等距离放入已经灭菌的牛津杯，每皿3组平行，牛津杯中放入不同放线菌滤液，28 ℃培养7 d后，根据抑菌圈有无及其大小判断抑菌活性大小。

同时，将5种病原菌倒平板，不同放线菌滤液分别滴加在同一个病原菌的平板内，28 ℃培养2 d后，根据抑菌圈有无及其大小判断抑菌活性大小。以放线菌LB-1做对照。

将复筛抑菌效果最佳的纯株放线菌存于高氏培养基上，4 ℃冰箱保存[7]。

2 结果与分析

2.1 菌种初筛结果

如表1所示，初筛试验结果表明，41556对5种病原菌病没有抑制作用，而LB-2、M-4、LB-8、M-8和M-9对几种病原菌的抑制相对较弱，LB-1、LB-9、LBM-7、LBI-1对5种病原菌的抑制效果比较明显，其中LBI-1抑制病原菌效果最明显。

表1 不同放线菌对5种病原菌抑制效果

2.2 复筛结果

2.2.1 对峙方法复筛结果

通过表2可以确定LB-1、LB-9、LBM-7、LBI-1对5种病原菌均有一定的拮抗效果；同一放线菌对不同病原菌的抑制效果不同，LB-2和LB-8对串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌无抑制效果；LBI-1综合抑制效果最佳。

表2 复筛放线菌对病原菌的抑制效果

2.2.2 杯碟法复筛结果

通过表3可以看出，LB-2、M-4的发酵液对几种病原菌没有抑菌作用；LB-8、M-9的发酵液有很小的抑菌作用；LB-9的发酵液对病原菌的抑菌圈不是透明的，边缘有些模糊；LB-1、LBM-7的发酵液对5种病原菌的抑制作用相当；LBI-1的发酵液在复筛的8种放线菌中对病原菌的抑制效果最佳，最大的抑菌直径达到41.88 mm。放线菌发酵液的获取时间分别为88 h和112 h，只有LBI-1的代谢产物延长培养时间后产物降低，其他几种放线菌都是随着培养时间的延长，代谢产物有不同程度的积累。

表3 不同取样时间的滤液抑菌直径大小（单位：mm）

3 结论

通过对10株放线菌的室内抑菌圈的筛选对比，最终确定了菌株LBI-1及其发酵液对串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、烟草赤星病菌、人参菌核病菌有明显的抑制效果。