藜麦（Chenopodium quinoa）内生菌LMJB-14的鉴定与生防促生功能研究

赵富清，谢天艳，秦宝福*

（1.西北农林科技大学，陕西咸阳 712199；2.青海省农林科学院，青海西宁 811600）

藜麦（Chenopodium quinoa）为藜科藜属一年生双子叶C3植物，是一种古老的安第斯粮食作物，在当地饮食中占有重要地位。藜麦富含多种营养物质和活性成分，是适合人类食用的全营养谷物，得天独厚的高原气候孕育出品质优良、产量丰富的藜麦作物。目前，藜麦已经在我国内蒙古、拉萨、甘肃、青海、宁夏以及山西等地广泛种植。随着藜麦种植规模的不断扩大和藜麦籽实食用价值的深入研究，对高原藜麦营养物质和活性成分的开发应用也越发广泛[1]。植物内生菌生活在健康植物中，能够增强宿主植物对生物胁迫及非生物胁迫的抗逆性，主要表现在抗旱、对病原菌拮抗等方面，提高宿主的抵抗能力[2]。藜麦内生菌的分离有利于丰富生防菌资源的开发与利用。

果蔬等在生长、采摘、运输、贮藏等过程中若处理不当，易腐烂变质，而真菌性病原菌是引起果蔬等腐烂的主导因素[3]。其中链格孢属（Alternariasp.）、镰孢菌属（Fusariumsp.）、刺盘孢属（Colletotrichumsp.）真菌为常见典型植物病原菌，可引起多种植物根、茎、叶、花、果实等病害，导致农产品的品质下降[4]。分离具有生防作用的内生菌，对于防治农作物病害具有重要的意义。

本研究对藜麦内生细菌进行分离纯化，并筛选对镰孢菌属、链格孢属、刺盘孢属等常见病原真菌具有抑菌活性的拮抗菌株，对其抑制活性进行初步研究以及菌种鉴定，以期为高原藜麦开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 材料

藜麦品种为“青藜2号”，由青海省农林科学院提供；炭疽菌（Colletotrichum nigrum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、链格孢菌（Alternaria alternata），由青海省农林科学院生物技术研究所提供。

马铃薯葡萄糖培养基（PDA培养基，配方为马铃薯 200 g、葡萄糖 15 g、琼脂 15 g、蒸馏水 1 000 mL），牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值为7.0～7.2）。

1.1.2 仪器

104T/02型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HIRAYAMA型高压蒸汽灭菌锅，华粤企业集团有限公司；SX2-12-16TP型电热恒温干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；BPH-9272型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；BS-1F型全温摇瓶柜，常州金坛精达仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藜麦内生菌拮抗菌筛选

（1）分离纯化。采集健康的藜麦植株，用流动清水洗净污垢并在超净工作台进行表面消毒：乙醇浸泡0.5 min、3%的次氯酸钠水溶液浸泡5 min。取出后用无菌水漂洗3～5次。采用组织分离法，将消毒后的藜麦组织用消毒灭菌的剪刀剪成0.5 cm的小块，用无菌镊子将各组织分别置于NA平板中，每个平板放置3块组织，设置3次重复，以最后一次漂洗液涂布平板检测有无杂菌污染。NA平板置于37 ℃的恒温培养箱培养2～3 d，当观察到试验材料边缘有菌长出后，根据菌落颜色、形态等特点挑选不同的单菌落纯化至单一菌株。

（2）初筛。采用平板对峙法进行初筛，以砖红镰刀菌为指示病原菌，将病原真菌活化接种于PDA平板中央，在距平板边缘2.5 cm处，接种6个筛选菌株，以只接病原菌为对照，每个处理重复3次，于30 ℃培养箱恒温培养，观察并测量抑菌带，对具有抑菌效果的菌株进行复筛。

（3）复筛。将3种供试病原菌菌饼与初筛活性菌株对称接种于PDA平板距平板边缘2.5 cm 处，以只接病原菌作为对照，每个处理重复3次，30 ℃培养7～10 d，观察并测量病原真菌菌落直径，计算出内生菌平均抑菌率，计算公式为：

式（1）中：D1和D2分别为对照菌落和处理菌落直径，mm。

1.2.2 拮抗菌的促生作用测定

选取消毒处理过的藜麦种子30粒，置于LMJB-14菌悬液中，浸泡4 h后移至无菌培养皿中，置25 ℃恒温培养箱中保湿培养。设3次重复，以无菌水浸泡作为对照。统计24 h发芽情况，计算萌发率，计算公式为：

式（2）中：L为萌发种子数，粒。

1.2.3 藜麦内生拮抗细菌的鉴定

（1）菌落形态特征。将拮抗细菌接种在NA平板上，30 ℃恒温培养24 h，观察内生菌的菌落形态。参考《常见细菌系统鉴定手册》[5]初步鉴定。

（2）分子生物学鉴定。提取拮抗细菌基因组总DNA，扩增其16S rRNA基因。由艾优稷生物科技有限公司（西安）完成测序。将序列提交至GenBank并进行BLAST序列比对，用MEGA7.0软件构建系统发育树，确定拮抗菌株的种属地位。

2 结果与分析

2.1 藜麦内生细菌的分离纯化及抑菌活性测定

从藜麦中共分离到内生细菌34株，其中3株内生细菌对供试植物病原菌具有抑制活性（图1）。经复筛，内生菌LMJB-14抑菌活性较高（图2），对炭疽菌、尖孢镰刀菌、链格孢菌的抑菌率分别为31.2%、23.2%、19.2%。

图1 初筛抑菌效果

图2 LMJB-14对常见植物病原真菌的抑菌效果

2.2 菌株LMJB-14对藜麦种子萌发的影响

菌株LMJB-14菌悬液浸种对藜麦种子的萌发有一定的促进作用（表1），其中，对照组与处理组萌发率分别为20.13%、50.9%，芽长分别为1.42 cm、1.98 cm，菌悬液浸种后种子萌发率增加了30.77个百分点。

表1 LMJB-14菌悬液浸种对藜麦种子萌发率和芽长的影响

2.3 藜麦内生拮抗细菌的鉴定

2.3.1 形态特征

菌株LMJB-14在NA固体培养基上呈现不规则、表面干燥皱褶、浅黄色菌落；革兰氏染色为阳性，短杆状含芽孢（图3）。

图3 菌株LMJB-14的形态学特征

2.3.2 分子生物学鉴定

将菌株LMJB-14的16S rRNA基因序列提交NCBI后，获得GenBank登录号MZ596243，经BLAST比对发现，菌株LMJB-14的16S rRNA基因序列与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的基因序列同源性达99%以上，系统发育树与贝莱斯芽孢杆菌聚为一支（图5）。结合菌株形态和生理生化特征，将菌株LMJB-14鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。

图5 菌株LMJB-14的系统发育树

3 结论

本研究筛选到藜麦内生菌LMJB-14对植物炭疽病病原菌（C. nigrum）、镰刀菌（F. equiseti）和链格孢菌（A. alternata）具有抑菌活性，对3种病原菌的抑菌活性依次减弱；LMJB-14菌悬液浸种对藜麦种子萌发及胚根生长具有显著促进作用；根据形态、生理生化特征，结合16S rRNA碱基序列和同源性分析，确定菌株LMJB-14为贝莱斯芽孢杆菌。

在植物病害防控方面，贝莱斯芽孢杆菌的生防作用非常突出，能够有效预防植物真菌性病害，与植物根际和叶面的共生菌协同具有促进植物生长、抑制病原菌的侵染和诱导植物系统抗性的作用[6]。如沙月霞等[7]从水稻叶片中分离到一株对多种植物病原菌具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌，对水稻叶瘟病的田间预防效果显著；曾欣等[8]从温郁金（Curcuma wenyujin）根茎中分离到一株具有拮抗活性的内生细菌贝莱斯芽孢杆菌B-11，对铁皮石斛炭疽病具有较强的防治效果；迟惠荣等[9]从多花黄精的根部分离出对尖孢镰刀菌具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌ZJU-3，对多花黄精具有显著的促生长作用。

藜麦内生菌贝莱斯芽孢杆菌LMJB-14具有抑制3种常见病植物病原真菌和促进藜麦种子萌发的作用，可用于开发农业生防资源及促生菌剂的研究。