miR-124-3p经Wnt通路因子Axin1调控骨髓间充质干细胞的研究

王斌 麦彩园 曹燕明 胡晖 黄春梅 林烨澎 邓杏容 徐茂森 董俊球*

1.佛山市三水区人民医院，广东 佛山528100

2.广东省妇幼保健院，广东 广州510010

3.广州医科大学附属第二医院，广东 广州510260

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是常见的代谢性骨疾病，临床特征以骨量及质量、骨强度下降为主[1]。我国骨质疏松症患者数量超过了7 000万，50岁以上女性患病率为20.7 %[2]。由于绝经后雌激素减少导致内分泌紊乱，进而影响钙质吸收利用，导致钙质流失出现骨量减少、骨骼破坏，以及腰背部疼痛症状，OP在绝经后妇女的发病率为未绝经女性的2～3倍[3]。OP的发病率逐年升高，骨质疏松不仅影响患者生活质量，也是重大的健康-经济-社会问题[4]。

破骨细胞(osteoclast，OC)和成骨细胞(osteoblast，OB)使骨骼处于重塑状态并维持正常的结构与功能[5]，它们维持的平衡被打破时，骨构建功能会异常，骨质疏松或骨代谢疾病等将发生[6]。MicroRNA (miRNA)是一种非编码蛋白单链小分子RNA，已经在肿瘤、骨代谢等多个领域被广泛研究[7]。miRNA主要通过与靶基因的3′端非编码区结合，对靶因子产生负性调控作用，导致其降解或停止翻译，从而影响细胞的增殖、迁移、凋亡[8]。近年来，miRNA在BMSCs及成骨与破骨中的生物作用越来越受到广泛的关注。miRNA是可以调控BMSCs向OB分化的，其对骨质疏松等相关疾病的治疗有重要价值[9]。miR-124-3p可通过抑制糖尿病性骨质疏松大鼠的GSK-3β/β-catenin信号传导途径促进BMSC成骨[10]。有研究[11]认为miR-124-3p通过靶向作用抑制Axin1促进乳腺癌生长。也有报道[12]Axin1作为OP的靶点，Axin1的缺失导致OPG增加和OC形成减少。

Wnt通路中，游离的β-catenin与GSK-3β结合后磷酸化，随后降解，如果Wnt信号被激活，Wnt与LRP5/6、FZD相互结合形成复合体，招集Dvl和降解复合物(由Axin、APC、GSK-3β等组成)，抑制GSK-3β对β-catenin的磷酸化。未磷酸化的β-catenin逐渐积累，进入到细胞核和TCF/LEF转录因子相结合，进而激活下游靶基因并转录表达[13]。轴抑制蛋白(Axin)是一种抑癌基因，在胚胎发育过程中控制体轴的形成，在许多重要的信号途径中扮演着重要的角色[14]。

Wnt通路中的Axin1是否可以作为miR-124-3p的靶点对BMSCs调节及机制还不清楚。本研究将探讨miR-124-3p对BMSCs调节的分子机制。

1 材料和方法

1.1 仪器及试剂

1.1.1仪器：紫外分光光度计、实时PCR检测系统、流式细胞仪、电泳仪及转膜仪：Bio-Rad公司，美国。荧光素酶报告检测系统：Progmega公司，美国。

1.1.2试剂：RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、引物：Takara公司，中国。BCA蛋白定量试剂盒：铎洋生物有限公司，中国。Western-Blotting一、二抗体：Abcam公司，美国。ALP试剂盒、茜素红染色试剂盒、载体：Bio-Rad公司，美国。DMEM高糖培养基、成骨分化培养液：Sigma公司，美国。胎牛血清、p-MiR report质粒、脂质体Lipofectamine 2000、293 T细胞：Invitrogen公司，美国。质粒抽提试剂盒：QIAGEN公司，德国。MiRNA模拟物及对照物及抑制物、RNAiMAX、Trizol试剂：吉玛制药公司，中国。

1.2 研究对象

1.2.1病例信息：研究方案按照1964年赫尔辛斯基宣言有关规定，经由佛山市三水区人民医院的临床试验伦理委员会审查通过，患者知情同意并签署知情同意书。本研究选择2020年1月至2020年12月在人民医院招募的绝经后妇女(股骨骨折，需手术并扩髓或暴露髓腔)20例，分为对照组10例和PMOP组10例。患者伤前活动能力、完全民事行为能力正常，无精神及认知障碍。入院后登记姓名、年龄、身高、体重等各项资料，所有受试者检测：腰椎骨密度均值及T值；骨转换标志物β-CTX、PINP、N-MID-OT、25(OH)D; 雌二醇。

1.2.2纳入及排除标准：PMOP组入组标准：满足前述条件；双能X线骨密度仪测骨密度T值≤-2.5，诊断为PMOP，可参照《绝经后骨质疏松的影像学表现及诊断标准》[15]；对照组入组标准：满足前述条件；双能X线骨密度仪测骨密度T值≥-1.0；排除标准：伴有严重慢性疾病；引起继发性PMOP的内分泌性等代谢异常的疾病；1年内因为OP接受相关药物或者激素治疗。

1.2.3骨标本收集患者在伤后3～7 d内根据骨折类型分别行髋关节置换术(6例)、有限切开骨折复位髓内钉内固定术(11例)、切开复位钢板内固定术(3例)。术中扩髓及髓腔刮出骨髓组织 5 mL，置于枸橼酸锂抗凝管中。

1.3 研究方法

1.3.1BMSCs细胞培养：术中从髓腔抽取骨髓5 mL，置于枸橼酸锂抗凝管中。建立BMSCs的体外培养体系及成骨分化：将骨髓与等体积的含l %双抗的DMEM培养液均匀混合。室温离心分离，去除上清。DMEM培养液重悬细胞，并将细胞悬液缓慢注入等体积Percoll分离液，室温离心，吸取中间的单个核细胞层，加入完全培养基，充分吹打混匀后可获得含有BMSCs细胞的悬液，于37 ℃，5% CO2培养箱进行培养。每24 h换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态、大小及分布。胰酶消化后，用DMEM培养基调节细胞浓度至2×105个/mL并接种于细胞培养板内培养。待细胞融合度达到70%～80 %后，胰酶消化传代培养。取对数生长期第3代BMSCs，加入成骨诱导液(含胎牛血清的α-MEM培养液、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠) 诱导2周，收取细胞并提取RNA，进行RT-qPCR。

1.3.2BMSCs鉴定：将分离培养的细胞于室温下离心并悬于PBS液中，分装于1.5 mL EP 管中(约1×106个细胞/管)，再离心后弃PBS液，保留50 μL PBS剩余减少以细胞丢失，于每管细胞样品中加用FITC标记的CD34、CD45、CD73、CD90、CD105以及单克隆抗体各10 μL，同时予以设立空白对照组，避光4 ℃环境下孵育30 min，应用适量PBS液轻柔清洗细胞两次以去除未标记抗体，用500 μL PBS液轻柔吹打重悬细胞后，流式细胞仪进行检测。

1.3.3RT-qPCR：取样品，移至1 mL RNAiso Plus液的EP管，混匀，加入氯仿0.2 mL，混匀，离心。上层水相移至离心管，加异丙醇，离心。移去上清液，加入乙醇。混匀，离心弃去上清，加无RNA酶水40 μL，读取OD值。参照反转录试剂盒反转录将RNA合成cDNA。用Primer Premier5.0软件设计、Takara公司合成的引物(引物序列5’to3’：miR-124-3p-F ACACTCCAGCTGGG, miR-124-3p-R CTCAACTGG TGTCGTGGA; Runx2-F CTCCTACCTGAGCCAGAT GACG, Runx2-R GTGTAAGTAAAGGTGGCTG GATAGT; Osterix-F CCAAGTGGGTGGTATAGAG, Osterix-R GGGATGGTGGGTGTAAGA; Axin1-F GGTTTCCCCTTGGACCTCG, Axin1-R CCGTCGA AGTCTCACCTTTAATG; GAPDH-F GGCATGG ACTGTGGTCATGAG, GAPDH-R TGCACCACCA ACTGCTTAGC; U6-F GGTGGTGGAGAACTCTTCA，U6-R GAGCAGCGTCTTCAGGAGCA)。反应体系：TaqMan®Fast Advanced Master Mix(2×)10 μL, TaqMan®Advanced miRNA Assay(20×)1 μL, cDNA反应液(1∶10 dilution)5 μL，Nuelease-free water 4 μL。按以下条件扩增：95 ℃预变性20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃ 20 s，40个循环。选择U6做内参基因，其他因子的内参为GAPDH。使用qPCR仪自带Rotor-Gene Q Software进行计算所有样品的Ct值，用2-ΔΔCT表示PMOP组因子相比对照组因子表达变化的相对表达量。

1.3.4Western Blotting(WB)：收集的PMOP组细胞用裂解液进行裂解，细胞冰上裂解30 min，离心，吸取上清液，依BCA蛋白标准液的方法配制工作液，在96孔板内上样，检测吸光度，再绘制标准曲线，计算出样品蛋白的浓度。蛋白加上样缓冲液(5×)，98 ℃加热10 min，然后根据浓度于各孔加入上样量及蛋白Marker。电泳60 V 30 min；105 V 1.5 h；转膜105V 1.5 h；脱脂奶粉孵育。将封闭后的NC膜置于脱色摇床上一抗4 ℃过夜14 h，取出膜洗涤，二抗于室温孵育1 h，洗涤膜，暗房显色剂显色。β-action为内参蛋白。软件Image J定量对比灰度值，算出各个蛋白相对表达值即为该蛋白表达水平。

1.3.5碱性磷酸酶(ALP)染色：根据ALP制造商的程序说明，测试ALP的活性。收集PMOP组BMSCs并用预冷的裂解缓冲液裂解。2 500g离心15 min收集上清液，然后用对硝基苯磷酸酯(PNPP)进行孵育。最后使用酶标仪在570 nm下测试OD值。

1.3.6茜素红染色：将PMOP组细胞用PBS洗涤3次并4 %多聚甲醛固定(15 min)，然后用0.2 %茜素红溶液染色30 min。用蒸馏水洗3遍后对染色的细胞照相。茜素红染色阳性检测细胞钙沉积，用来反应成骨细胞的钙化。

1.3.7细胞转染：购买上海基因制药有限公司的miR-124-3p模拟物(mimics)(5’-UAAGGCACG CGGUGAAUGCC-3′) 和相应的阴性对照(NC group)(NC, 5’-GAUGCACGGACGUGCGAAU-3′)、miR-124-3p 抑制物(inhibitor)和对照NC。细胞密度5×105铺于6孔板中，等细胞融合度达到90%后，吸出培养液并用PBS缓冲液冲洗2遍，更换为Opti-MEM培养液，每孔3 mL，并用Opti-MEM培养液将质粒分别稀释至20 μmol/L，同时用转染试剂稀释，取对应分组的RNA加入到转染试剂中，孵育20 min后加入到培养液中，培养6 h后换普通培养液，继续培养48 h后进行表达量验证。miR-124-3p过表达48 h后更换成骨诱导培养基进行成骨诱导培养。在诱导的7、14、21 天分别收集各组细胞进行检测ALP和茜素红染色。共分为BMSC组、BMSC+成骨分化液组、BMSC+过表达miR-124-3p对照组(NC)、BMSC+过表达miR-124-3p组(mimics)。成骨诱导第7 天 用RT-qPCR、Western Blotting检测各组BMSCs成骨特异性基因Runx2和Osterix的表达及靶因子A的表达。

1.3.8双重荧光素酶报告基因检测：利用http://www.targetscan.org/vert_71/网站预测，miR-124-3p可能结合的Wnt通路靶位点因子A-Axin1。为了验证结合位点，我们进行荧光素酶结合试验，将包含预测的miR-124-3p结合位点的Axin1 3′-UTR克隆到pMIR-REPORTTM miRNA Expression Reporter载体中，并将所得质粒命名为pMIR-Axin1-WT(野生型)。使用定点诱变试剂盒，通过突变结合位点(GUGCCUU)区域创建了一个突变的Axin1报告基因，并将其命名为pMIR-Axin1-MT(突变型)。为了进行转染，将细胞接种到24孔板中，并使用Lipofectamine 2000将100 ng pMIR-Axin1-WT或者pMIR-Axin1-MT荧光报告载体和50ng miR-124-3p mimics共转染到293 T细胞中。48 h后，根据说明用荧光素酶测定系统(Promega)测量荧光素酶活性。

以上所有样本实验重复3次。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 患者一般资料、骨转换标志物

患者一般资料见表1，骨转换标志物等见表2。

表1 对照组和PMOP组内一般资料比较Table 1 Comparison of general data between control group and PMOP

表2 对照组和PMOP组骨转换标志物的比较Table 2 Comparison of bone turn over markers between control group and PMOP

2.2 BMSCs培养及鉴定

流式细胞术分析BMSCs(图1)，CD73、CD90和CD105的表达为阳性，而 CD34 和 CD45 的表达呈阴性。符合间充质干细胞的抗原特点，证实为BMSCs。

2.3 RT-qPCR法检测miR-124-3p在对照组与PMOP组的BMSCs中表达

miR-124-3p在BMSCs中的相对表达值，对照组为3.66±0.04，PMOP组为1.24±0.05(P< 0.05)。

2.4 RT-qPCR验证miR-124-3p过表达

将模拟物过表达转染48 h的细胞收集并提取RNA，后进行RT-qPCR实验，结果显示模拟物过表达转染后细胞miR-124-3p表达水平显著升高，相对表达值由2.54±0.87升高至6.98±1.65(P<0.05)。

2.5 过表达miR-124-3p后成骨能力

同时将各组传代细胞进行miR-124-3p过表达转染。48 h后，将培养液更换为成骨诱导液培养，于培养的第7、14、21天，进行ALP和茜素红染色实验。结果显示过表达miR-124-3p后随着诱导时间的延长，细胞培养液中ALP水平逐渐升高，茜素红染色可见结节沉积逐增加(图2、3)。

在培养第7天收集细胞并提取RNA，RT-qPCR显示各组BMSCs成骨特异性基因Runx2和Osterix的表达，BMSC+成骨分化液组明显高于BMSC组，BMSC+过表达miR-124-3p组较对照组明显升高；特异性靶因子Axin1的表达：BMSC+成骨分化液组明显低于BMSC组，BMSC+过表达miR-124-3p组较对照组明显降低(图4)。

2.6 miR-124-3p与A-Axin1结合位点验证

使用数据库验证miR-124-3p与Axin1的潜在结合靶点，其结合位点如图5所示。而荧光素酶报告基因结果显示miR-124-3p可显著抑制野生型pMIR-Axin1-WT(野生型)的萤光素酶活性，而不影响突变型荧光报告基因活性(图6)。对293 T细胞进行了WB检测，结果显示miR-124-3p过表达组Axin1表达显著下降(P<0.05)，而miR-124-3p抑制组表达显著升高(P<0.05)，Axin1表达与miR-124-3p表达水平呈负相关，见图7。

3 讨论

绝经后骨质疏松(PMOP)是由于女性绝经后体内雌激素水平迅速下降，破骨细胞增加导致的骨吸收大大增加，导致骨吸收大于骨形成引起的代谢性疾病[15]。BMSCs医学上也被成为“多能细胞”，可以分化为成骨细胞、软骨细胞等，研究表明在老龄OP状态时，BMSCs成骨分化紊乱，成骨分化能力下降[16]。BMSCs在成骨活性的研究对骨缺损、成骨减少和障碍类疾病具有重要指导意义[17]。miRNA作为一种具有调控功能的非编码单链RNA，大量存在于BMSCs内，影响成骨、破骨细胞的增殖、迁移和分化等多种生物学功能过程[9-10]。近年来，miRNA对BMSCs分化及对破骨细胞、成骨细胞分化的影响已成为热点问题, miR-124-3p在PMOP调控成骨和破骨中发挥一定的作用[10]。

Qadir等[18]发现在人BMSCs的分化过程中miR-124-3p的表达改变可能影响了BMSCs的生物学功能。Liu等[19]研究发现对mrl/lpr BMSCs的凋亡小体进行处理后，miR-124-3p表达增加。RANKL降低破骨细胞形成过程中miR-124的表达，miR-124降低破骨细胞前体的增殖和活力[20]。有实验[10]证实miR-124-3p可以促进成骨分化，并且通过抑制GSK-3β调控绝经后骨质疏松症大鼠BMSC成骨的发生。

另一方面，已有研究[10,21-22]显示Wnt/β-catenin信号通路与BMSCs成骨分化相关，研究及数据库表明miR-124-3p可能参与Wnt信号通路，其作用靶点包括Frizzled、LRP5/6、GSK-3β、Axin1等。Shu等[12]研究OB前体细胞中Axin1的缺失导致OPG增加和破骨细胞形成减少。张磊等[23]已经研究证实了包括 Axin在内的多个信号分子均可能参与BMSCs的成骨分化，沉默或过表达个别基因的表达可以促进BMSCs的成骨分化，对骨组织工程学研究及其相关疾病的治疗具有重要意义。在本研究中，通过RT-qPCR方法分析检测miR-124-3p在BMSCs诱导分化为成骨细胞的表达，结果显示过表达miR-124-3p后BMSCs成骨分化能力明显增强；miR-124-3p在PMOP组降低；模拟物过表达转染后细胞miR-124-3p表达水平也显著升高，说明miR-124-3p可能参与PMOP的形成过程。

通过miRNA靶基因预测网站，根据miRNA的序列信息预测靶基因A-Axin1与miR-124-3p的潜在结合位点。合成了靶基因Axin1野生型和突变型的结合序列。导入miR-124-3p的模拟物与Axin1野生型荧光素酶的mRNA3’-UTR插入的目的序列能够结合，pMIR- Axin1-WT+ miR-124-3p模拟物组的荧光强度显著降低，说明Axin1是miR-124-3p的靶基因。而在成骨诱导第7天，Runx2和Osterix的表达：BMSC+成骨分化液组明显高于BMSC组，BMSC+过表达miR-124-3p组较对照组明显升高；Axin1的表达：BMSC+成骨分化液组明显低于BMSC组，BMSC+过表达miR-124-3p组较对照组显降低。推论Axin1可能是miR-124-3p的潜在结合靶点。进一步在293 T细胞中进行了WB检测，WB结果显示miR-124-3p过表达组Axin1表达显著下降，而miR-124-3p抑制组Axin1表达显著升高，因此，Axin1表达与miR-124-3p表达水平呈负相关。从而为miR-124-3p通过调控Axin1从而影响BMSCs的成骨分化提供了证据。

本实验也存在一些不足，没有进一步验证在过表达靶基因Axin1后，验证miR-124-3p对骨细胞功能的调节作用。综上所述，本研究证实miR-124-3p可通过Wnt通路靶点Axin1调节BMSCs的成骨分化进而参与PMOP的形成过程。本研究可为PMOP患者诊治及研究提供相关依据。