LINC00847促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

马 鑫，朱 涛

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，也是全球常见的三大癌症之一[1]。2012年全球乳腺癌新增确诊病例约170万例，死亡病例约50万例[1-2]。虽然内分泌药物和CDK4/6抑制剂等的使用明显提高了乳腺癌患者的总生存率，但复发和转移仍是尚未攻克的难题[3]。因此，对乳腺癌发生、发展机制的研究至关重要。有研究表明LINC00847表达异常与肝癌、肾癌以及非小细胞肺癌的进展相关[4-6]。目前关于LINC00847影响乳腺癌的发生、发展以及具体机制的报道极少。本文通过RNA干扰技术沉默乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中LINC00847的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响，补充lncRNA在乳腺癌发生、发展中发挥的重要作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系与试剂人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231以及人胚胎肾细胞系293T(ATCC)；RPMI-1640培养基、DMEM培养基、ECORI内切酶和AgeI内切酶(购自赛默飞公司)；胎牛血清(FBS)(BI公司)；Trizol总RNA提取液(美国Invitrogen公司)；无EDTA胰蛋白酶(美国Life Technoiogy公司)；蛋白裂解液(碧云天生物公司)；逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒(全式金生物公司)；Costar 8.0 μm孔径Transwell小室(美国Corning公司)。

1.2 LINC00847-shRNA真核表达载体构建使用siRNA Wizard在线软件设计LINC00847的shRNA，LINC00847-shRNA-1引物序列：5′-CCGGGCTCTAA CAAAGCCTCTGTCTGGATCCAGACAGAGGCTTTGTT AGAGCTTTTTG-3′，LINC00847-shRNA-2引物序列：5′-CCGGGATCATGGCAGTGGCATTATAGGATCCTAT AATGCCACTGCCATGATCTTTTTG-3′。退火处理：从99 ℃起逐渐降至4 ℃停止，每分钟下降1 ℃。用Solution Ⅰ连接酶将退火产物与已用ECORI和AgeI酶切过纯化的载体Plko.1 16 ℃连接3 h，连接结束后取10 μL连接产物转化到感受态DH5α细胞中。挑取单菌落，摇菌6 h后抽取质粒，酶切后跑胶鉴定然后送测序再次鉴定。

1.3 慢病毒的包装和稳转细胞系的构建使用二代慢病毒包装三载体(pMD2G、psPAX2和待包装质粒)系统和磷酸钙法在293T细胞中包装病毒，并用0.22 μm的滤膜过滤培养基，收取24 h和48 h的病毒。将24 h收取的病毒加入到提前种好的丰度约为50%MCF-7细胞培养皿中感染24 h，随后换液，加入48 h收取的病毒感染细胞24 h。换成新鲜的培养基，后加入2 μm嘌呤霉素筛选1周，以构建稳定表达目的质粒的细胞系。最后收集部分细胞进行qRT-PCR鉴定，检测LINC00847被敲低后继续进行后续实验。

1.4 qRT-PCR使用Trizol试剂法提取细胞的总RNA。依照逆转录试剂盒说明书配好逆转录体系，加入1 μg新提取的总RNA按照42 ℃ 15 min的程序将其逆转录为cDNA。根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书避光配好反应体系，然后加入cDNA混匀后放入实时荧光定量PCR仪中进行反应。

1.5 MTT实验检测MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖能力在超净台中弃去细胞培养液，PBS洗细胞1次，胰酶消化细胞，离心后用1 mL新鲜培养基重悬，取100 μL细胞悬液稀释10倍后使用血球计数板对细胞进行计数，计数后根据细胞数量稀释成浓度为每毫升2×104个的单细胞悬液，在96孔板中每孔加入100 μL单细胞悬液，同时每个处理组设置6个复孔，做5个相同的96孔板连续检测5天。24 h后弃去培养液，然后在每孔加入100 μL用培养基稀释10倍的MTT液，37 ℃培养箱中孵育2 h后弃去MTT液并沥干，每孔中加入100 μL的DMSO并避光轻摇15 min。最后用酶联免疫检测仪读取96孔板各孔中OD570 nm。

1.6 克隆形成实验检测MCF-7和MDA-MB-231细胞克隆形成能力在超净台中弃去细胞培养液，PBS洗细胞1次，胰酶消化细胞，离心后用1 mL新鲜培养基重悬，取100 μL细胞悬液稀释10倍后使用血球计数板对细胞进行计数，计数后根据细胞数量稀释成浓度为每毫升1×103个的单细胞悬液，6孔板中每孔加入2 mL上述单细胞悬液，每个处理组做3个重复孔。8天后弃去培养基，PBS洗2遍，加入1 mL 90%乙醇固定30 min，弃去乙醇，晾干后加入1 mL结晶紫染色30 min，清洗后拍照留存。

1.7 Transwell实验检测MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力在超净台中弃去细胞培养液，PBS洗细胞1次，胰酶消化细胞，离心后用1 mL新鲜无血清培养基重悬，取100 μL细胞悬液稀释10倍后使用血球计数板对细胞进行计数，计数后根据细胞数量稀释成浓度为每毫升5×105个细胞的无血清单细胞悬液。分别取200 μL单细胞悬液加入到无和有Matrigel包被的Transwell小室的上室中，在下室加入600 μL含有10%FBS的完全培养基，分别培养48、56 h(MDA-MB-231则分别培养12、14 h)。培养结束后，取出小室用90%乙醇固定30 min，弃去乙醇，晾干后再使用结晶紫染色30 min。最后使用沾湿的棉棒将小室内部细胞轻轻拭去，显微镜下拍照并保存。

2 结果

2.1 LINC00847-shRNA的干扰效率检测采用qRT-PCR检测稳转MCF-7和MDA-MB-231细胞中LINC00847-shRNA的干扰效率。结果显示，与对照组Plko.1组相比，shRNA-1组和shRNA-2组

LINC00847的水平显著下调(P<0.001，图1)。

图1 qRT-PCR检测MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)细胞中LINC00847的表达水平

2.2 沉默LINC00847对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖能力的影响使用稳转细胞系进行MTT实验，检测沉默LINC00847对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖能力的影响。结果显示，与Plko.1组相比，shRNA-1组和shRNA-2组的细胞增殖能力显著下降(P<0.001，图2)。

图2 MTT实验检测沉默LINC00847对MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)细胞增殖能力的影响

2.3 沉默LINC00847对MCF-7和MDA-MB-231细胞克隆形成能力的影响使用稳转细胞系进行克隆形成实验，检测沉默LINC00847对MCF-7和MDA-MB-231细胞克隆形成能力的影响。结果显示，与Plko.1组相比，shRNA-1组和shRNA-2组的细胞克隆形成能力显著下降(P<0.001，图3)。

图3 克隆形成实验检测沉默LINC00847对MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)细胞克隆形成能力的影响

2.4 沉默LINC00847对MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响使用稳转细胞系进行Transwell实验，检测沉默LINC00847对MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示，与Plko.1组相比，shRNA-1组和shRNA-2组的细胞迁移和侵袭能力均显著下降(P<0.001，图4)。

图4 Transwell实验检测沉默LINC00847对MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响

3 讨论

乳腺癌是全球女性患病率最高的恶性肿瘤，病死率位居女性恶性肿瘤的第2位[7]。目前乳腺癌治疗主要原则是精准化和综合性治疗，首选手术治疗，术后辅以化疗，同时联合运用内分泌治疗、靶向治疗等，虽然这些治疗方法在一定程度上提高了疗效和患者的生活质量，但是术后复发再治疗依旧是亟待解决的难题[8-9]。近年来，发现与乳腺癌治疗相关的生物标志物越来越多。郭欠影等[10]发现ARHGDIB的高表达能够促进乳腺癌细胞的阿霉素耐药。魏瑜等[11]发现RUNX3能够通过Wnt/β-catenin通路抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。即便如此，关于乳腺癌术后复发和转移的具体分子机制仍未明了。因此，乳腺癌研究领域迫切需要对乳腺癌发生、发展相关基因进行更加系统、全面和深入的研究。

lncRNA是长度大于200 nt，不具有编译蛋白质能力的一类RNA[12]。lncRNA可以通过多种方式行使调控功能，如顺式或反式调控基因的转录，与蛋白质或RNA相互作用，影响核结构域的组织等[13]。有多种lncRNA可以促进癌症的发展、转移和耐药，并在许多人类癌症中表现出组织特异性表达，体现出它们潜在的临床相关性[14]。许多lncRNA的表达特征与乳腺癌患者预后、生存率和疾病复发有关，这些相关因素可以帮助完善疾病管理策略[15-16]。更重要的是，乳腺癌中的组织特异性lncRNA表达可以作为临床上有用的生物标志物来区分正常组织和肿瘤组织或乳腺癌亚型[17-20]。lncRNA作为乳腺癌的标志物能够促进早期乳腺癌的诊断并且提高治疗疗效[18,20-25]。靶向lncRNA也可能拮抗癌症的进展，改善临床前景[26]。LINC00847位于5号染色体长臂，是一种新鉴定的lncRNA，在肾细胞癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤中均有LINC00847的异常表达[5,27-28]。Li等[4]发现LINC00847可被E2F1诱导，上调的LINC00847通过调节miR-147a/IFITM1轴促进非小细胞肺癌的进展。Tu等[6]发现LINC00847通过充当miR-99a的海绵诱导E2F2表达从而促进肝细胞癌进展。但是，乳腺癌中异常表达的LINC00847的具体功能尚未见相关文献报道。为探究LINC00847的表达对乳腺癌的影响，本实验选用经典的乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231构建了shRNA稳转敲低细胞系，然后检测细胞各种功能的变化。实验结果显示：沉默LINC00847的表达后，MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖能力、克隆形成能力、迁移以及侵袭能力均显著下降。

综上所述，沉默LINC00847的表达可抑制乳腺癌的增殖、迁移以及侵袭能力。由于LINC00847在乳腺癌中表达异常，推测LINC00847可能参与乳腺癌发生、发展的进程，并为乳腺癌的治疗和诊断提供新思路，但LINC00847发挥功能的分子机制仍需深入探究。