p16/Ki-67手工染色与全自动免疫组化仪染色效果对比

高丽丽，李 青

p16蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，p16在细胞周期的阻滞期具有抑制细胞增殖的功能[1]。Ki-67表示细胞周期进展及增殖活跃[2]。两者同时表达在一个细胞周期则提示细胞周期失调。正常生理状态下，p16和Ki-67的表达相互制约，不会同时表达于一个细胞中。若p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测阳性，提示子宫颈上皮内病变2级(cervical intraepithelial neoplasias 2, CIN2)及以上病变[3-6]。Van等[7]提出p16与Ki-67免疫组化双染可独立于形态学找及癌细胞。Ikenberg等[8]同样发现，在子宫颈高级别上皮内病变中p16/Ki-67免疫组化双染法比细胞学检查具有更高的灵敏度。近年，越来越多的实验室应用全自动免疫组化仪进行p16/Ki-67双染，但手工染色仍占多数。本实验分别进行p16/Ki-67手工染色和全自动免疫组化仪双染，比较染色效果，优化染色流程，最终达到良好的染色结果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2021年1～3月上海市浦东新区人民医院存档的子宫颈活检标本35例，其中子宫颈慢性炎15例，低级别鳞状上皮内病变(low squamous intraepithelial lesion, LSIL)9例，高级别鳞状上皮内病变(high squamous intraepithelial lesion, HSIL)9例，鳞状细胞癌2例。病理诊断均经两名经验丰富的病理医师分别阅片后共同确诊。组织均经固定、脱水、包埋和切片后待用。

1.2 主要试剂及仪器p16(SD390兔抗)/Ki-67(MIB1鼠抗)检测试剂盒(手工)购自广州深达公司。BOND聚合物检测系统DS9800/DS9390购自德国Leica公司。全自动免疫组化染色均在Leica BOND MAX全自动免疫组化仪上操作。

1.3 手工染色流程(1)烤片：60 ℃ 1～2 h。(2)脱蜡水化：将组织切片依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，无水乙醇Ⅰ 1 min，无水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各30 s，双蒸水冲洗30 s。(3)抗原修复：pH 9.0的EDTA修复液高温高压修复2 min，自然冷却至室温。(4)阻断内源性过氧化物酶：室温孵育5 min，PBS冲洗30 s。(5)一抗孵育：p16/Ki-67抗体室温孵育30 min，PBS冲洗。(6)二抗孵育：HRP/AP聚合物室温孵育20 min，PBS冲洗。(7)Fast-red显色：Fast-red显色液(试剂A-Fast-red底物和试剂B-Fast-red底物缓冲液按1 ∶9比例配置)，室温显色20～30 min(镜下观察适当调整染色时间)，PBS冲洗终止显色。(8)DAB显色：DAB显色液(染色液B-DAB和A-DAB底物缓冲液按1 ∶20比例混匀)室温显色3～5 min(镜下观察适当调整染色时间)，双蒸水冲洗终止显色。(9)复染：苏木精染色30～60 s，返蓝后流水冲洗干净。(10)封片：除去玻片上多余液体，添加适量水溶性封片剂(不用加盖玻片)，45～55 ℃烘箱烘干10～20 min，直至凝固。

1.4 全自动免疫组化仪染色流程采用顺次双染法：抗原修复后进行第一种抗体的染色并显色，显色完毕后再进行第二种一抗及第二套显色系统的染色，最后复染封固(图1)。

图1 Leica BOND MAX全自动免疫组化仪p16/Ki-67双染运行程序

2 结果

细胞内显示棕色着色为p16阳性，定位于细胞质和细胞核；红色着色为Ki-67阳性，定位于细胞核，手工染色与全自动免疫组化仪染色结果一致，p16/Ki-67染色鲜明，对比明显(图2、3)。在同一细胞中同时存在特异性棕色细胞质和红色细胞核着色，便视为p16/Ki-67双染阳性。

图2 手工染色：子宫颈上皮细胞p16/Ki-67双染阳性，EnVision两步法 图3 全自动免疫组化仪染色：子宫颈上皮细胞p16/Ki-67双染阳性，EnVision两步法

3 讨论

邱晓阳等[9]研究发现，p16/Ki-67双染检测对于鉴别子宫颈细胞学阴性且高危型人乳头状瘤病毒阳性而TCT阴性的子宫颈上皮内病变2/3级具有较高的灵敏度和特异性，对于组织学为低级别鳞状上皮内病变的患者转归同样具有预测价值。潘思琼等[10]研究表明，p16/Ki-67免疫组化双染也弥补了TCT中主观因素导致的漏诊及误诊。p16/Ki-67双染作为子宫颈癌的新兴筛查技术，判读清晰明确，可减轻诊断医师的阅片负担；与Ki-67、p16单染效果相比，双染更加节省玻片、试剂，染色更高效；检测无需特殊仪器，可降低科室成本，适合在各级医院开展，尤其是手工染色更适用于欠发达地区。

因此，本实验旨在探讨p16/Ki-67手工染色和全自动免疫组化仪双染效果，分析两种染色结果的一致性。实验发现p16/Ki-67双染试剂盒手工染色与全自动免疫组化仪染色效果一致性高，均适合p16/Ki-67双染。手工染色实验体会如下：(1)碱性修复选择染色通用性更高的碱性修复方式。(2)Fast-red显色液和DAB显色液应现配现用。(3)染色结束后，切记玻片不能接触乙醇，乙醇可使显色剂溶解，导致染色失败。(4)封片剂为水溶性，无需加盖玻片。(5)染色顺序需考虑到Ki-67为胞核染色而p16为胞质、胞核均着色，为避免p16先在胞核中着色形成的显色物质对后续染色影响，将Ki-67先于p16进行染色。

综上所述，p16/Ki-67免疫组化双染技术在病理诊断中尤为重要，一些基层医院无法开展全自动免疫组化染色，手工染色可以达到同样的效果；全自动免疫组化仪操作也需与其他实验方法对比，制定出适合本实验室最优的染色流程，从而为临床诊断提供可靠的结果。