不同实验器皿对Gomori六胺银染色的影响

徐圆圆，朱忆凌

随着抗生素、糖皮质激素、化疗药物、免疫抑制剂等药物种类的不断增多及药物应用范围的扩大，极大地降低了患者的免疫力，使得真菌感染的发病率呈上升趋势[1-3]。临床上，真菌感染缺乏特征性的影像学表现，并且在显微镜下无法直接观察，特殊染色可提高对其观察的特异性和敏感性[4]。Gomori六胺银染色是将真菌内部的黏多糖化合物经氧化后暴露并释放出醛基，醛基将六胺银液还原成金属银，在黑色金属银显现的过程中能完整保存真菌菌丝及孢子的形态，易于观察和分辨[5-7]。六胺银染色操作便捷、图像显示清晰，已逐渐成为鉴别真菌的经典方法，对真菌感染的诊断具有客观直接的意义。在实际工作中，六胺银染色效果受到多种因素的干扰，染色缸的清洁是干扰因素之一，染色缸若清洁不彻底，使得过多的银离子吸附在缸体表面而非病理组织切片上，影响染色显像的实际效果。本实验拟使用3种不同器皿对真菌进行六胺银染色，以比较其优劣。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取2019～2020年丽水市中心医院病理科收集的20例真菌感染组织，其中曲霉菌9例(45%)，放线菌3例(15%)，隐球菌2例(10%)，孢子丝菌2例(10%)，毛霉菌2例(10%)，其他未知菌种2例(10%)。真菌感染组织均经10%中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。每例真菌感染组织均切片3张以供后续实验使用。

1.2 分组将实验分为3组，以实验器皿的不同进行划分：A组为使用病理切片盒进行后续染色；B组为使用化学洁净玻璃染色缸进行后续染色；C组为使用未经清洗、消毒的玻璃染色缸进行后续染色。每组染色20张切片。

1.3 方法

1.3.1试剂及配置 六胺银染色试剂盒(六胺银法)购自赛诺特生物公司。铬盐清洗液配置：在1 000 mL蒸馏水中加入120 g重铬酸钾，将200 mL浓硫酸缓慢加入混合液中，待混合均匀后避光保存。病理切片盒购自上海世泽生物公司，其主要成分是透明聚丙烯。

1.3.2实验过程 (1)清洗：将B组待用玻璃染色缸在铬盐清洗液中浸泡20 min，流水冲洗5 min，蒸馏水冲洗2 min，烘干后备用。C组玻璃染色缸仅以蒸馏水冲洗5 min，甩干备用。(2)染色：将处理后的病理组织切片放入1%碘酸钠水溶液中15 min，流水洗涤5 min，蒸馏水冲洗2 min，之后在65 ℃水浴箱中将病理组织切片浸入六胺银贮备液中20～30 min，组织切片外观将呈黄褐色，之后将病理组织切片蒸馏水冲洗30 s，0.1%氯化金水溶液调色1～2 min，海波液定影1 min，水流冲洗5 min，后乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封固，镜下即可查见黑褐色真菌。三组病理组织切片的染色过程相同，仅染色容器有所不同。每组染色20张切片，操作总时间取平均值。

1.4 评估指标及内容(1)比较三组染色过程中镜下真菌染色的着色力度，菌丝和孢子颜色、形态和清晰度，来比较不同器皿六胺银真菌染色的差异。(2)由两名副主任医师对60张切片染色效果进行评分，评分从背景清晰度、切片菌丝形态清晰度、着色力度、染色力度几个层面进行，最高分为10分。(3)比较三组切片染色操作总时间。

2 结果

2.1 A组染色情况A组使用病理切片盒作为染色器皿，染色20～25 min时可观察到真菌被着色且着色力度强，银颗粒在器皿壁附着较少(图1)，染色背景清晰，可清晰地观察到黑褐色菌丝和孢子，形态可辨(图2)；染色30 min时出现银镜反应，着色过深，背景颜色亦过深，无法辨认。

图1 组织切片在病理切片盒中染色20～25 min后，银颗粒吸附表现 图2 组织切片在病理切片盒中染色20～25 min后镜下表现 图3 组织切片在化学洁净缸中染色20～25 min后，银颗粒吸附表现 图4 组织切片在化学洁净缸染色中染色20～25 min后镜下表现 图5 组织切片在未经清洗、消毒的玻璃染色缸中染色20～25 min，银颗粒吸附表现 图6 组织切片在未经清洗、消毒的玻璃染色缸中染色25 min后镜下表现

2.2 B组染色情况B组使用化学洁净玻璃染色缸作为染色器皿，染色20～25 min(图4)、30 min的表现与A组相近，唯一不同点是，染色缸壁吸附少量银颗粒，玻璃壁吸附银离子呈浅黄色(图3)。

2.3 C组染色情况C组采用未经清洗、消毒的玻璃染色缸作为染色器皿，染色20～25 min后镜下观察切片上色不清晰，着色力度不佳，背景呈现模糊浅褐色(图6)，玻璃壁吸附较多银离子，呈黄色(图5)；染色30 min时出现银镜反应，背景因缸壁吸附过多银离子而变得不清晰，菌丝与孢子着色过深无法辨认。

2.4 染色总操作时间从器皿清洗到实验结束，A组操作总时间为(61±1.357) min，C组操作总时间为(60.75±0.716) min，两组操作时间相比差异无显著性(t=0.729，P=0.213)；B组操作总时间为(83.3±1.625) min，与A组相比差异有显著性(t=47.095，P<0.001)，与C组相比差异有显著性(t=56.773，P<0.001)。

2.5 切片染色评分与诊断准确率A组切片染色评分与B组相比差异无显著性(P>0.05)，与C组相比差异有显著性(t=15.565，P<0.05)。A组切片的诊断准确率(100.0%)与B组(95.0)相比差异无显著性(χ2=1.026，P=0.311)，但与C组(50.0%)相比差异有显著性(χ2=13.333，P<0.001，表1)。

表1 不同分组切片染色评分与诊断准确率对比[n(%)]

3 讨论

真菌感染病例的临床表现、病理特征、影像学表现方面均缺乏特异性，存在较高的漏诊、误诊率。临床医师需依赖病理诊断了解致病菌群，以采取针对性治疗。在病理学上，通过六胺银对菌体进行组织化学染色，将真菌内部的多糖氧化后，利用暴露的醛基还原六胺银溶液中的黑色金属银，使得菌体黑染，是观察真菌形态的最佳方法之一。

在实验中，六胺银染色效果受诸多因素的影响，其中实验器皿的选择至关重要。在温水浴中，银氨液被醛基还原为银，因物理吸附可不断被吸附于玻璃壁上。不洁染色缸壁上有大量蛋白、糖、脂肪等，除物理吸附，同时还进行化学反应，溶液中的Ag+被消耗，过多的吸附于缸壁，而使得病理组织切片上Ag+吸附过少，降低真菌组织的着色程度，甚至过早出现银镜反应，导致染色失败。以往文献中亦未报道可用于六胺银染色的最佳实验器皿，以往使用的实验器皿均需使用强氧化性和腐蚀性的铬盐清洗液浸泡清洗才可用于实验，所以寻求一种安全有效方便的实验器皿具有十分重要的意义。作者在工作中首次发现，常规使用的病理切片盒对银颗粒的吸附力远比玻璃缸弱，无需清洗即可达到较好的实验效果，且切片盒大小合适，成本低、易购买。其做为实验器皿，应用于Gomori六胺银染色中，简便易行，染色效果佳。本实验将病理切片盒的染色效果与化学洁净玻璃染色缸、非洁净玻璃染色缸进行对比分析，结果显示，使用病理切片盒作为染色器皿，与化学洁净玻璃染色缸具有相同的染色效果，在染色20～25 min时可呈现较好的真菌染色着色力度，菌丝、孢子形态可辨，且背景清晰。化学洁净玻璃缸在使用时玻璃缸壁也会呈现浅黄色，另一组非洁净的玻璃染色缸，实验效果欠佳，此实验证明六胺银染色对实验器皿较为敏感。一直用于清洗玻璃器皿的清洗液通常由浓硫酸、高锰酸钾配置，具有强烈的腐蚀性、氧化性，对人体可造成潜在危害性，在采购、运输、使用、废弃等环节中均存在不便性。相比玻璃器皿，使用病理切片盒无需考虑清洗液等诸多不便环节，且染色效果更佳。

六胺银染色法对真菌的鉴别力度高，已成为鉴别真菌感染的诊断标准之一。常规染色过程耗时长，需2～3 h，且前期器皿清洁与试剂配制繁琐、稳定性低，影响检验的准确性。本实验结果显示，使用病理切片盒进行染色，与未洁净的玻璃缸染色时间相当，染色效果与使用洁净玻璃缸相同。这提示病理切片盒联合六胺银试剂盒，可大幅减少操作时间，且染色结果稳定，效果良好，可避免多次重复实验。

本实验采用了3种不同的实验器皿进行六胺银染色，结果显示在病理切片盒中进行六胺银染色表现最佳，染色效果好，操作时间短，是最优选的实验器皿。