跨膜丝氨酸蛋白酶4在乳腺癌细胞MCF-7中影响细胞侵袭和转移的作用机制*

李明亮，赵建英，田 笑，栾 亮，刘 静，蔡 婧

北部战区总医院检验科，辽宁沈阳 110016

乳腺癌是全球范围内女性最常见的肿瘤之一，同时也是女性肿瘤相关死亡的第二大原因[1]。尽管目前在乳腺癌早期诊断和治疗中取得了明显成效,但乳腺癌的高发病率和高病死率仍引起全球广泛关注，并且乳腺癌的各种不良预后绝大部分源于肿瘤的复发和转移[2-3]。因此，研究乳腺癌的侵袭和转移机制并寻找新的治疗靶点十分重要。 跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)是Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族中的一员，TMPRSS4水平可在多种肿瘤中呈高表达，包括胰腺癌、胃癌、结直肠癌等，由于其具有胰酶活性，可能在肿瘤的转移和侵袭过程中起重要作用[4]。近年来有研究表明，TMPRSS4参与多种肿瘤细胞的转移和侵袭，包括前列腺癌、肺癌[5]和肝癌[6]等。近期有研究表明，TMPRSS4水平在乳腺癌细胞MDA-MB-231中呈高表达且通过上皮细胞间充质化(EMT)进程调控肿瘤的转移和侵袭[7]。MCF-7细胞是常见的雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞，TMPRSS4在乳腺癌MCF-7细胞中的生物学作用及分子机制尚不清楚。本研究不仅检测了TMPRSS4在MCF-7细胞中的表达情况，还通过干扰其表达水平探讨其在肿瘤发生和发展中的生物学功能，为寻找乳腺癌治疗的新靶点提供依据。

1 资料与方法

1.1材料 人正常乳腺细胞HBL-100，MCF-7、ZR-75-1、ZR-75-30 3种乳腺癌细胞，所有细胞株均来源于中国医科大学遗传学教研室。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 中国杭州博日科技有限公司聚合酶链反应(PCR)扩增仪，美国罗氏公司实时荧光定量PCR(qPCR)扩增仪Light Cycler，美国阿尔法公司电泳凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad凝胶电泳仪，日本奥林巴斯倒置相差显微镜。

1.2.2试剂 MEM培养基(美国Gibco公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒(日本Takara公司)，qPCR试剂盒(日本Takara公司)，BCA蛋白含量检测试剂盒(中国南京凯基生物科技发展有限公司)，兔抗人TMPRSS4多克隆抗体(美国Abcam公司)，Transwell小室(美国Corning公司)，实验所用慢病毒购于上海吉满生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养 人正常乳腺细胞HBL-100、乳腺癌细胞MCF-7在细胞常规条件下培养，正常换液和传代，待细胞长满瓶底后，选取生长状态良好的细胞冻存备用。

1.3.2qPCR 采用Trizol法提取总RNA，采用紫外分光光度计检测标本RNA浓度和纯度，以A260/A280在1.8～2.0提示标本满足要求。按反转录试剂盒操作说明书反转录成cDNA，然后进行PCR扩增分析，引物委托上海吉满生物科技有限公司合成，扩增体系50 μL：Taq酶1 μL、Taq buffer 5 μL、MgCl23 μL、 dNTP 1 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 37 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共40个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳，采用Bio-Rad分析系统扫描分析，TMPRSS4基因表达水平= TMPRSS4基因A值/β-actinA值。

1.3.3Western blot 按照BCA试剂盒说明书提取总蛋白，然后进行Western blot。电泳条件：浓缩胶80 V，分离胶100 V，时间1.5 h；转膜条件：200 mA,时间2 h。显色成像后用Image J软件进行灰度值分析。

1.3.4慢病毒转染MCF-7细胞 慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒为基础改造得到的基因治疗载体，慢病毒转染后可以使目的基因整合到细胞染色体中，并且稳定、持久地表达。本实验用包含有TMPRSS4干涉片段基因的慢病毒包装质粒转染MCF-7细胞，从而获得病毒包装后的重组慢病毒载体，由上海吉满生物科技有限公司构建。实验共设3组，分别为含TMPRSS4干涉片段的慢病毒转染MCF-7细胞(LV-TMPRSS4-RNAi组),不含TMPRSS4干涉片段的慢病毒转染MCF-7细胞(NC组)，未用慢病毒转染的MCF-7细胞(Control组)。先根据病毒与细胞数量比值(MOI)不同分组，通过预实验确定慢病毒感染细胞的MOI和最佳感染条件。制备含50 μg/mL Polybrene的培养基P(M)，含50 μg/mL Polybrene的ENI.S感染增强溶液P(E)各200 μL。按表1加入相应溶液形成A、B、C、D 4种条件，混匀培养，转染72 h后，采用荧光显微镜观察感染效率，感染效率80%以上作为转染最佳条件，正式转染时使用。

1.3.5转移和侵袭实验 根据文献[6]介绍的方法进行划痕实验及制备细胞侵袭模型。将细胞悬液接种于六孔板中，待细胞融合接近100%时，用中枪头划痕，用磷酸盐缓冲液清洗细胞后，在无胎牛血清培养基上继续培养，分别于0、24 h后拍照，观察细胞转移能力。用基质胶包被Transwell上室，制备侵袭模型。常规培养24 h后，用结晶紫染液染色后于显微镜下观察细胞侵袭能力的变化情况。

2 结 果

2.1TMPRSS4在乳腺癌细胞中的表达水平 TMPRSS4在正常乳腺细胞及3种乳腺癌细胞中mRNA和蛋白表达水平见图1(GAPDH为蛋白内参)，与正常乳腺细胞比较，TMPRSS4在3种乳腺癌细胞中均呈高表达。

2.2慢病毒转染效率和干涉效果 慢病毒转染后TMPRSS4在乳腺癌细胞MCF-7中表达水平比较见表2。慢病毒转染MCF-7细胞72 h后，采用荧光显微镜观察转染效果，见图2A。Western blot检测转染后TMPRSS4蛋白表达水平见图2B。

表2 慢病毒转染后TMPRSS4在乳腺癌细胞MCF-7中表达水平比较

注：A为mRNA表达水平；B为蛋白表达水平。

注：A为慢病毒转染；B为TMPRSS4蛋白表达水平。

2.3TMPRSS4沉默表达的MCF-7细胞转移和侵袭能力的变化 TMPRSS4沉默表达的MCF-7细胞株转移和侵袭能力均减弱，见图3。

注：A为转移实验；B为侵袭实验。

3 讨 论

乳腺癌是女性常见的肿瘤。在美国，女性肿瘤患者中大约有33%是乳腺癌，在全球范围内，乳腺癌在肿瘤致死原因中居第2位[8-9]。而在乳腺癌患者中，只有10%的死亡是由原发肿瘤引起，其余90%均是通过局部入侵淋巴、血管扩散转移到肝、肺、骨和大脑等器官导致患者死亡。有研究显示，乳腺癌可在早期就发生转移，其发生转移的机制是多种因素共同作用的结果[10]。有研究表明，酪氨酸蛋白激酶可通过TAZ和STAT5信号调控骨-肿瘤相互作用来促进乳腺癌的溶骨性转移[11]；半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CST1)高表达可促进乳腺癌细胞增殖、增强其转移和侵袭能力，相反CST1沉默则会减弱这种恶性特征[12]；CHI等[13]研究发现，T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域蛋白高表达后也可以通过激活原癌基因MYC来促进乳腺癌细胞的转移和侵袭。有些因素会抑制乳腺癌的转移，有研究表明，miR-124-3p可以通过抑制原癌基因CBL的表达负向调控乳腺癌细胞的转移和侵袭[14]；miR-199a-5p在三阴性乳腺癌中可以通过抑制EMT进程来抑制肿瘤的转移和侵袭[15]。

TMPRSS4是Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族中的一员，TMPRSS4可在多种肿瘤中过表达，且参与肿瘤的侵袭和转移。有研究证明，TMPRSS4在大肠癌中过表达，并且可促进FAK、ERK1/2、 Akt、Src和Rac1活化，上调整合素-α5 调控肿瘤细胞的侵袭[16]。在前列腺癌和肺癌细胞中，TMPRSS4可诱导uPA基因表达，通过依赖JNK的方式激活转录因子AP-1、Sp1/3的活性调控癌细胞的侵袭和转移。另外，有研究显示，在肝癌细胞中，TMPRSS4过表达可明显促进肝癌细胞的侵袭和转移来诱导肿瘤血管的生长。有研究表明，在乳腺癌MDA-MB-231细胞中TMPRSS4可通过促进波形蛋白和Slug，抑制E-cadherin和claudin-1的表达来促进乳腺癌细胞的转移和侵袭[17]。本研究发现，TMPRSS4在MCF-7细胞中呈高表达，并且在肿瘤的转移中起促进作用。本研究通过慢病毒转染MCF-7细胞干扰TMPRSS4的表达来研究其生物学功能，目前慢病毒转染被广泛应用于表达RNAi的研究中，慢病毒载体可以将外源性基因有效整合到目标细胞染色体上，起干扰目标基因表达的作用，并且能够长期抑制目标基因在细胞中的表达。本研究发现，随着TMPRSS4表达水平的改变，MCF-7细胞的转移和侵袭能力也发生变化。慢病毒转染MCF-7细胞后使TMPRSS4表达沉默，其转移和侵袭能力明显减弱。由此可以得出TMPRSS4可促进MCF-7细胞转移和侵袭的结论。

本研究推测，TMPRSS4通过调控表皮生长因子受体(EGFR)基因表达来发挥作用。EGFR是一种酪氨酸激酶受体蛋白，属于ErbB家族。EGFR功能多样，有研究显示,EGFR表达失控与肿瘤的转移密切相关[17]。有研究发现，头颈部肿瘤、结直肠癌、乳腺癌、肺癌和膀胱肿瘤等均存在EGFR过表达[18]。EGFR还参与EMT进程的发生和癌细胞的转移,与癌细胞的增殖、运动、生存和转移有关。近期有研究表明，miRNAs和其他蛋白可通过调控EGFR水平发挥生物学功能，在结直肠癌中，miR-520a-3p 可通过调控EGFR表达水平发挥肿瘤的抑制作用[19]。在乳腺癌细胞中POPDC1可负调控EGFR诱导的细胞转移和增殖。在导管腺癌细胞中，claudin-18通过EGFR/RAS/ERK通路过表达，对癌细胞的转移和侵袭发挥促进作用[20]。由此，本研究推测，在乳腺癌MCF-7细胞中TMPRSS4也可能通过调控EGFR表达水平来调控肿瘤的转移、侵袭等生物学进程，这是下一步研究的重点。

综上所述，TMPRSS4在乳腺癌MCF-7细胞中呈高表达，并且可增强细胞的转移和侵袭能力，加速肿瘤的进展。