骨形态发生蛋白9在门静脉性肺动脉高压中的作用机制

张瑞华，秦婷婷，邵玥明,2，张 雨,1b，温晓玉

1 吉林大学第一医院 a.肝胆胰内科，b.小儿内分泌遗传代谢科，长春 130021； 2 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心 感染与免疫科，上海 201508

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PAH)是由多种病因及发病机制所致的肺血管结构或功能改变，引起肺血管阻力和肺动脉压力升高的临床和病理生理综合征，继而发展为右心衰竭，甚至死亡。肺部病理学特征是血管壁中内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞增殖导致小肺动脉狭窄和闭塞[1]，肺血管阻力升高进而导致严重PAH。应用现有治疗方法后平均无移植3年生存率仍只有60%～70%[2-3]。门静脉性肺动脉高压(portopulmonary hypertension，POPH)是在门静脉高压(伴或不伴慢性肝病)基础上出现肺动脉压力升高。2018年，第六届世界肺高血压会议[4]将POPH归为1类PAH(1类PAH指特发性、遗传、药物和毒素诱导、新生儿综合征、具有肺静脉闭塞性疾病或肺毛细血管血管瘤病以及与以下内容相关的PAH：结缔组织病、门静脉高压症、先天性心脏病、血吸虫病等)。骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9，BMP9)，也称为生长分化因子2 (growth differentiation factor 2，GDF2)[5]，其作为内皮细胞保护因子及血管稳态因子，通过其自身及受体和下游效应物参与PAH及POPH发病，现将BMP9信号通路及其在PAH及POPH发病中的作用等方面的研究进展作一总结。2016年国际肝移植学会实践指南[6]指出：将POPH根据右心导管测定的平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure，mPAP)进行分级，可分为轻度(25 mmHg≤mPAP<35 mmHg)、中度(35 mmHg≤mPAP<45 mmHg)和重度(mPAP≥45 mmHg)。

1 POPH流行病学及其发病机制

1951年Mantz和Craige[7]发现了第1例POPH。POPH发病率低，不同研究中其发病率不同，在PAH中占5%～10%[8]，在门静脉高压患者中占1%～2%[9]，即使在肝移植患者中也仅占2%～6%[10]。

由于POPH发病率低，临床相关样本量少及与之相关的动物模型建立困难，其发病机制尚不清楚。目前研究考虑其发病机制主要有以下几种。(1)晚期肝病患者门静脉高压，其高动力循环及外周血管阻力降低，导致肺循环血流增加，肺动脉遭受剪切应力增加，造成肺血管内皮受损，进而原位血栓形成、血管内皮细胞增殖，肺动脉压力进行性升高[11]。(2)血管活性物质失调：内皮细胞和血管平滑肌细胞对血管紧张度的调节是由平衡的血管扩张剂(如前列环素和一氧化氮)和血管收缩剂[包括内皮素(endothelin，ET)1]介导的。肝脏合成、分解代谢功能受损以及门静脉高压引发各种血管功能障碍级联反应，从而影响肺部血管系统[12]。门静脉高压引起的门体分流允许局部产生或积累的血管活性化合物绕过肝脏进入不同的血管。此外，肠道微生物群及其相关的具有强血管活性、内皮靶向性和细胞毒性特性的双产物的变化可进一步使血管功能障碍复杂化和扩散，从而破坏TGFβ、前列腺素、ET、一氧化氮或血管内皮生长因子信号通路，ET-1、IL-1、IL-6等引起血管收缩物质增加，一氧化氮、前列环素等引起血管舒张物质减少[13]，PAH形成与这种平衡向过度肺血管收缩的转变有关。(3)氧化应激：POPH患者氧化应激程度升高，抗氧化系统失调[14]。(4)雌激素：性别对PAH发展有影响，根据潜在疾病病理，女性与男性之比约为4∶1[15]。Sehgal等[16]提出物种特异性雌性(“更连续型”)与雄性(“脉动型”)循环生长激素水平的时间模式，解释了为什么女性比男性更易患PAH；Al-Naamani等[17]研究发现POPH患者尿液中16α羟基雌酮及血浆16α羟基雌二醇升高，其通过促进增殖、促炎及氧化应激等促进肺血管重塑，证实了雌激素信号通路与POPH密切相关。(5)免疫性因素：自身免疫性肝病患者POPH风险增加[18]。(6)遗传易感性：遗传性PAH是常染色体显性疾病，在高危人群中外显率低(平均20%～30%)。研究[19]发现携带骨形态发生蛋白受体(bone morphogenetic protein receptor，BMPR)2突变患者更容易发生PAH，疾病更严重，死亡更快。相关研究[20-21]表明，遗传性PAH患者BMP9及其受体和下游效应物存在功能缺失突变，在此基础上Nikolic等[22]发现POPH患者血浆BMP9较其他原因的PAH患者明显减低，当BMP9血浆浓度低于132 pg/mL时，BMP9对识别POPH具有较高敏感度及特异度。因此，BMP9信号通路获得性缺失可能也参与POPH发病。

2 BMP9结构、生理表达及其作用

BMP属于TGFβ超家族，首次被发现是在骨和软骨形成中起重要作用[23]。目前在已知BMP调节早期发育、器官发生和细胞分化的各个方面，作为成熟组织体内平衡的关键调节剂发挥更广泛的作用。目前已知人类有15个BMP配体，其中仅BMP9与BMP10具有高序列相似性。虽然BMP9在2000年首次报道[24]，但直到2007年2项研究[25-26]同时报道BMP9是激活素受体样激酶(activin receptor-like kinase,ALK)1的高亲和力配体，优先作用于血管内皮细胞，抑制血管生成并赋予血管内环境稳定，方才引起人们的广泛关注。

与其他BMP相似，BMP9合成429个氨基酸的前体(pre-pro-BMP9)，包含22个氨基酸的信号肽，297个氨基酸的前结构域和110个氨基酸的成熟蛋白[5,27]。然后，该前体被丝氨酸内切蛋白酶切割以产生成熟的蛋白质二聚体(25 kD)，该二聚体可以与2个前结构域(每个33 kD)保持非共价结合，形成100 kD的复合物[28](图1)。当与前结构域复合时，成熟BMP9二聚体仍保持其生物活性[28-29]。结合的前结构域被认为增强了BMP9在体内的稳定性。100 kD循环前BMP9复合物中约有60%被切割并具有活性，而其余40%未加工，可通过局部furin蛋白酶切割而被激活[28]。BMP9表达存在组织特异性，其主要在肝脏[24,30]中被检测到，在肺[30]和大脑[5,31]中也有较低水平表达。

注：BMP9合成429个氨基酸前体，包含22个信号肽，297个前结构域和110个成熟蛋白，该前体被丝氨酸内切蛋白酶切割产生成熟蛋白质二聚体，该二聚体与两个前结构域保持非共价结合，形成100 kD复合物。

BMP9具有广泛的生物学功能，包括葡萄糖稳态与胰岛素抵抗、脂肪形成、血管生成、神经发生、肿瘤发生、淋巴管成熟及成骨等作用(图2)，其中BMP9作为一种血清静止因子，可抑制内皮细胞增殖和血管形成。Scharpfenecker等[25]研究发现，应用BMP9可有效抑制碱性成纤维生长因子刺激的细胞生长，但对细胞增殖未见影响。同时，研究发现BMP9完全消除血管内皮生长因子诱导的管状结构形成，表明BMP9是体外血管生成的有力抑制剂。Park等[32]发现人肺动脉血管内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cell，HPAEC)中生理浓度BMP9可通过Smad1和p38 MAPK介导显著刺激ET-1释放，进而抑制内皮细胞迁移，其中ET-1是由21个氨基酸组成的多肽，是血管收缩剂和有丝分裂原[33]。同时，BMP9可作为内皮细胞保护因子维持内皮完整性。趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)是参与单核巨噬细胞趋化的关键趋化因子，Upton等[34]在实验中发现BMP9依赖ALK1、活化素受体Ⅱa型(Activin receptor-Ⅱa,ACTR-Ⅱa)和骨形态发生蛋白受体Ⅱ型(BMPR-Ⅱ)抑制人肺动脉内皮细胞和主动脉内皮细胞CCL2的基础表达和释放。Chen等[35]研究了支气管肺发育不良和PAH中的BMP9信号传导，发现BMP9能够改善异常肺泡发育，还减少了肺部炎症和血管外胶原沉积，而对正常的新生儿肺部发育未见负面影响。

图2 BMP9生理作用

3 BMP9/ALK1/BMPR-Ⅱ/Endoglin/Smad信号通路

BMP9/ALK1/BMPR-Ⅱ/Endoglin/Smad信号通路在调节血管形成与稳态维持中发挥着重要作用，ALK1是TGFβ/BMP家族蛋白的Ⅰ型受体，也是肝脏非实质细胞中BMP9的主要受体[36-37]。BMPR-Ⅱ是TGFβ信号传导途径的成员，其介导的信号传导在维持内皮完整性及屏障功能方面至关重要[38]。BMPR2功能缺失突变是PAH最常见的遗传原因[39]，肺血管BMPR-Ⅱ表达减少是遗传性和特发性PAH特征[40]。BMPR2突变已在约70 %家族性PAH和高达25 %散发性PAH中得到证实[41]。内皮糖蛋白(Endoglin)也被称为CD105，是一种跨膜蛋白，具有较大的胞外域和富含丝氨酸/苏氨酸的胞质区，其不能单独结合配体，但可以作为辅助受体，在Ⅰ型或Ⅱ型信号传导受体存在下结合BMP9。已知ALK1或内皮糖蛋白突变是引起遗传性出血性毛细血管扩张症的主要遗传原因，并且在遗传性出血性毛细血管扩张症类综合征患者中也报告了罕见的BMP9变异[42]。Smad蛋白家族包含8种蛋白，可被分为3个亚族：调节性Smad(R-Smad)，共同性Smad(Co-Smad)，抑制性Smad(I-Smad)。其中，Co-Smad可与R-Smad结合转导信号，而I-Smad下调Smad活化调节受体稳定性从而抑制信号转导[43]。BMP9是半胱氨酸结同源二聚体生长因子，是作用于内皮细胞的主要BMP配体[26]，其通过与2个Ⅰ型受体(ALK1)和2个Ⅱ型受体(包括BMPR-Ⅱ、ACTR-Ⅱa和/或Ⅱb)形成复合物发挥作用。当BMP9结合后，Ⅱ型受体组成型活性丝氨酸-苏氨酸激酶结构域磷酸化并激活Ⅰ型受体，激活的I型受体磷酸化下游底物蛋白R-Smad的C端，一旦R-Smad磷酸化便进一步与共同性受体Smad4形成复合物，最终转移至细胞核内进而调节靶基因的转录。

4 BMP9信号通路参与PAH及POPH发病的作用机制

因POPH与其他形式PAH之间组织病理学相似，故POPH发病机制多来源于对PAH的研究。基于BMP9保护内皮细胞和维持血管稳态的作用，国内外研究人员针对BMP9信号通路及其与PAH乃至POPH的相关性进行了一系列研究工作(图3)。2016年，Wang等[44]报道了1例罕见BMP9纯合无义突变，突变中第26位氨基酸从谷氨酰胺转变为终止子，BMP9过早截断导致功能丧失，研究者认为正是这种BMP9功能丧失，降低了BMPR-Ⅱ及ALK1的表达，并破坏了其与内皮糖蛋白的相互作用，从而导致PAH发病，其中无义突变的纯合性解释了该患者为何早期发病及发病的严重程度。GDF2基因编码BMP9，Hodgson等[45]通过对一个欧洲PAH患者队列进行功能分析发现了GDF2基因罕见破坏性突变，大多数突变导致成熟蛋白质的细胞加工改变和分泌减少，进而导致BMP9循环水平及活性降低。这些发现支持了突变在PAH病理生物学中的因果作用，并为人类BMP9水平和活性降低促进PAH发展提供了有力的证据。

图3 BMP9在PAH肺血管重塑中作用

然而，在特发性PAH中BMP9扮演什么样的角色仍然存在分歧。ET-1作为血管收缩剂和有丝分裂原，其已被证明可调节内皮细胞迁移和血管生成，Star等[46]通过体外研究指出，PAH时BMP9刺激人肺微血管内皮细胞释放ET-1进而导致PAH。在此基础上，Park等[32]发现HPAEC中BMP9可通过Smad1和p38 MAPK介导显著刺激ET-1释放，从而诱导内皮细胞小管形成，导致肺血管重塑。上述研究在一定程度上支持BMP9在PAH发病中的促进作用。此外，研究[47-48]发现血浆ET-1水平与PAH患者血流动力学严重程度呈正相关，与预后呈负相关。近年来随着对BMP9信号通路的深入了解，越来越多的非遗传临床证据支持BMP9信号减少在PAH发病中的因果作用[49]。Long等[38]实验发现BMP9不仅保护肺动脉内皮细胞免于凋亡并促进血管稳定性，还增加了BMPR2基因表达及信号传导，其中BMPR2在维持内皮完整性及屏障功能方面有着重要的作用。在体外，BMPR2丢失使HPAEC倾向于凋亡，内皮增殖并增加HPAEC单层通透性；在体内，BMPR2丧失导致肺血管通透性增加。应用重组BMP9直接增强内皮BMP信号传导可以预防和逆转几种遗传和非遗传临床前啮齿动物模型中的PAH，为使用重组配体靶向治疗PAH提供了可能性。Dunmore等[50]首次报道了BMPR-Ⅱ依赖溶酶体的降解机制，并通过实验证实溶酶体抑制剂氯喹可通过抑制BMPR-Ⅱ降解进而增加其水平，同时改善了下游信号传导。相比之下，Tu等[51]研究发现，BMP9通过诱导ET-1等因子和抑制肾上腺髓质素和apelin等血管舒张因子而赋予血管收缩作用，从而提出选择性抑制BMP9可部分抑制实验性PAH。最近又通过对小鼠进行BMP9单基因敲除、BMP9+BMP10双基因敲除，发现BMP9基因敲除减弱了慢性缺氧诱导的肺小动脉肌化，且BMP9缺陷小鼠ET-1明显下降[52]，从而进一步验证了其之前的结论。

通过上述研究，可以明确BMP9参与了PAH发病。那么，既然POPH作为1类PAH的一部分，那BMP9是否参与了POPH发病？如果参与了发病，其在POPH发病中发挥了正面还是负面作用？为了寻找答案，Nikolic等[22]对暴露于低氧的小鼠应用BMP9配体陷阱ALK1-Fc，结果发现其加剧了小鼠PAH和肺血管重塑，直接证明了BMP9的保护作用，从而提出获得性BMP9信号转导缺陷可导致PAH。之后其又对POPH及1类PAH的其他病因、2类PAH和3类PAH的BMP9水平进行了测量，发现POPH患者循环BMP9明显减少，同时监测BMP9拮抗剂可溶性内切酶(sEng)，结果显示POPH患者sEng水平更高。通过上述实验分析，Nikolic提出BMP9是POPH敏感和特异性生物标志物，通过临床数据分析，其又指出BMP9可预测无移植生存率和肝脏疾病中PAH存在。随着当前医疗技术的不断发展，POPH诊断逐渐进入临床，心电图、胸片、血气分析、肺功能、超声心动图等对POPH诊断率偏低，而右心导管插入术作为POPH诊断标准，因其为有创操作，且肝硬化患者凝血功能差，故右心导管插入术一般不被接受。因此，寻找无创性非侵入性POPH生物标志物是非常有益的。

5 小结与展望

BMP9作为内皮细胞保护因子和血清静止因子，其抑制内皮细胞凋亡、迁移、增殖和维持血管稳态。在上述报道和探索中，BMP9信号通路通过其自身及受体和下游效应物参与PAH及POPH发病机制中的作用已得到证实，然而BMP9参与POPH的具体发病机制比较复杂，仍需要进一步研究。由于POPH患病率低，POPH样本量少导致关于BMP9信号通路参与POPH发病机制的研究受限，因此仍需要收集大量样本进行研究。因POPH通常无特异性表现，临床医生在评估门静脉高压患者时，特别对于血氧饱和度<95%或存在呼吸困难、疲乏、胸痛、晕厥、咳嗽明显患者，应及时完善超声心动图等相关检查，从而早期发现POPH，随着包括BMP9信号通路在内的POPH发病机制相关研究的深入，有望为POPH的治疗开辟新路径。

利益冲突说明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：张瑞华负责课题设计，资料分析，撰写论文；秦婷婷、邵玥明、张雨参与收集数据，修改论文；温晓玉负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。