不同提取条件对吊干杏杏仁蛋白结构特性的影响

糟龙，陆健康，2*，张春兰，2*，彭修春，曹甜甜，焦清波，齐薇燕

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

吊干杏又称“树上干杏”，因其熟后不落，在树上风干而得名，种植地区主要集中在新疆伊犁和阿克苏地区[1]。吊干杏杏肉味美，营养丰富，含糖量高达27%[2]。研究发现甜杏仁营养成分包括蛋白质、脂肪、维生素等，其中蛋白质含量十分丰富，高达30.9%，并且含有17种氨基酸，其中8种氨基酸为人体所必需[3]，因此杏仁蛋白是一种优质植物蛋白，具有很高的食用价值和产品开发价值。

当前，国内外学者对杏仁的研究主要集中在以下几个方面：杏仁蛋白的提取及其功能特性研究[4]；杏仁油脂提取及其生物活性研究[5]；不同提取方法（碱溶酸沉法、酶法、碱酶二步法、超声辅助碱法、超声辅助酶法以及水提和酶辅助水提法）对杏仁蛋白功能特性[6]和生物学特性[7]的影响。事实上，同一提取方法的不同分离条件也会影响蛋白质提取率、结构特性和功能特性[8]，不同分离条件对蛋白质提取率和功能特性的影响已有相关研究，而不同分离条件对蛋白质结构特性的影响研究鲜有报道。

目前对吊干杏的研究大多集中于吊干杏杏树的栽培管理[9]、杏肉的采后贮藏[2]和保鲜[1]等，而对于吊干杏杏仁相关产品的深加工研究较少，因此，为推动杏仁产业的快速发展，有必要对吊干杏杏仁蛋白进行进一步研究。而对于蛋白质的提取如碱溶酸沉提取法，采用不同pH值进行碱溶处理或酸沉处理会造成蛋白质的空间结构发生改变。因此为减少提取条件对蛋白质空间结构产生的不良影响，本研究以新疆阿克苏地区的吊干杏杏仁为试验材料，采用碱溶（pH8、pH10、pH12）酸沉（pH4.5）方法分离提取杏仁蛋白，并研究不同的分离条件（碱溶pH值）对杏仁蛋白结构特性的影响，以期为吊干杏杏仁蛋白的深加工提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新疆阿克苏地区吊干杏杏仁：市售；磷酸氢二钠：洛阳市化学试剂厂；磷酸二氢钠、溴酚蓝：天津市风船化学试剂科技有限公司；十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）：天津市博迪化工股份有限公司；丙烯酰胺、过硫酸铵：西格玛奥德里奇贸有限公司；尿素、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disosium salt，EDTA-2Na）：天津致远化学试剂有限公司；四甲基乙二胺、2-硝基苯甲酸（2-nitrobenzoic acid，DNTB）：上海海曲化工有限公司；彩虹180光谱蛋白marker（生物制剂）：北京索莱宝科技有限公司；甘氨酸、三（羟甲基）氨基甲烷：上海山浦化工有限公司。以上化学试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

电子天平（LE203E）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机（GL-22LM）：湖南星科科学仪器有限公司；全自动定氮仪（KDY-9830）：北京市通润源机电技术有限责任公司；冷冻干燥机（FD-1-50）：北京博医康实验仪器有限公司；酸度计（PHS-3C）：北京哈纳科学仪器有限公司；超声波清洗机（SB-5200DT）：宁波新芝生物科技股份有限公司；数显恒温水浴锅（HHS-S4）、电热鼓风干燥箱（BGZ-246）：上海博迅实业有限公司；紫外分光光度计（UV2450/2550）：北京普析通用仪器有限公司；荧光光度计（Lumina）：上海君翼仪器设备有限公司；TG-DSC热分析系统（STA449F3）：耐驰科学仪器商贸（上海）有限公司；电泳仪（DYY-6C）：北京六一仪器厂；纳米粒度及ZETA电位分析仪（ZSE）：马尔文帕纳科上海思百吉仪器系统有限公司；比较测色仪（WSL-2）：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 吊干杏杏仁蛋白的制备

将吊干杏杏仁粉碎后过40目筛，采用索氏提取法以石油醚为有机溶剂脱脂8 h，自然挥干12 h后粉碎过60目筛，得到吊干杏杏仁脱脂粉[10]。

参考Malomo等[11]的方法提取蛋白，探究不同碱溶pH值条件提取的蛋白对其结构性质的影响。脱脂粉∶水=1 ∶10（g/mL）混合，用 1 mol/L 的 NaOH 调至 pH8、pH10、pH12，25℃下磁力搅拌1 h后，4℃条件下离心（7 000 r/min，15 min），收集上清液后用上述条件对沉淀重复提取4次。合并上清液、过滤，用1 mol/L HCl调节pH值至4.5[12]。静置20 min，在相同条件下离心后收集沉淀，用去离子水洗涤沉淀至中性，样品冷冻干燥，即得杏仁蛋白粉。样品1、2、3分别代表碱溶pH8、pH10、pH12，酸沉pH4.5条件下得到的杏仁蛋白粉。

1.2.2 吊干杏杏仁蛋白基本成分测定

1.2.2.1 水分测定

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥法测定水分[13]。

1.2.2.2 灰分测定

参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》中的干法灰化法测定灰分[14]。

1.2.2.3 蛋白质含量测定

参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯式定氮法测定蛋白质含量[15]。

1.2.3 表面疏水性的测定

参考CHELH等[16]的方法采用溴酚蓝法测定表面疏水性，并作适当修改。将3种蛋白粉溶于pH7，0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，使蛋白浓度达到5 mg/mL。取1 mL上述配制好的5 mg/mL蛋白样液，加入200 μL1 mg/mL溴酚蓝，并以无蛋白样液的磷酸盐溶液为对照。25℃下8 000 r/min离心15 min后，取上清液稀释10倍，测定其595 nm波长下的吸光度A。每种蛋白测定3次后取平均值，溴酚蓝结合量计算公式如下。

溴酚蓝结合量/μg=200×（A对照-A样品）/A对照

式中：A对照为无蛋白样液的磷酸盐溶液在595 nm波长下的吸光度；A样品为蛋白样液在595 nm波长下的吸光度。

1.2.4 巯基含量的测定

参考于小番等[17]方法测定杏仁蛋白巯基含量，并作适当修改。

1）游离巯基的测定：取2 mL制得的蛋白样液（将吊干杏杏仁蛋白溶于pH7、0.02 mol/L磷酸盐缓冲液中，使蛋白浓度达到5 mg/mL），加入5 mLTris-甘氨酸缓冲溶液（0.086 mol/LTris、0.09 mol/L 甘氨酸、4 mmol/L EDTA-2Na混匀后调pH值为8）中，再加入0.1 mL 4 mg/mL DTNB的Ellman试剂（将DTNB溶于pH7、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液中），在25℃下涡旋混匀后保温反应15 min，用分光光度计测定412 nm处的吸光度A，以不加Ellman试剂的溶液作为空白对照，3组蛋白每组测定3次取平均值。

2）总巯基的测定：将上述游离巯基的测定中加入5 mLTris-甘氨酸缓冲溶液换为5 mLTris-甘氨酸-8 mol/L尿素-0.5%SDS缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液中再混入8 mol/L的尿素与0.5%SDS溶液中25℃超声混匀），其他步骤同游离巯基的测定。

巯基含量计算公式如下。

式中：-SH为巯基含量，μmol/g；D为样品稀释系数；C为样品的蛋白最终浓度，mg/mL。

1.2.5 羰基含量测定

参考吴大伟等[18]的方法测定蛋白羰基含量，并作适当修改。将3种蛋白分别溶于pH8、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液中，使蛋白浓度为5 mg/mL。取1 mL配制好的5 mg/mL蛋白样液，加入1 mL含有10 mmol/L的2，4-二硝基苯肼和2 mol/L的盐酸溶液后涡旋混匀，30℃恒温避光水浴1 h后，在每组离心管中加入0.4 mL 40%三氯乙酸，涡旋混匀并静置15 min，10 000 r/min离心15 min后弃上清液，随后加入1 mL无水乙醇∶乙酸乙酯=1∶1（体积比）重复洗涤蛋白质沉淀3次。将得到的蛋白质沉淀悬浮于6 mol/L的含有磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）pH7、0.2 mol/L 盐酸胍溶液中，在37℃恒温水浴20 min。空白为加1 mL不含2，4-二硝基苯肼的2 mol/L盐酸，其他步骤同上。测定370 nm下的吸光度，每组样品测定3次取平均值，以摩尔消光系数为22 000 L/（mol·cm），计算各组样品中每mg蛋白质羰基衍生物的摩尔数。羰基含量计算公式如下。

式中：DF为样品稀释系数；ε为摩尔消光系数，22 000 L/（mol·cm）。

1.2.6 紫外吸收光谱扫描

参照Li等[19]的方法，3种蛋白分别溶于磷酸盐缓冲液（pH 7、0.2 mol/L）中，使蛋白浓度为 1 mg/mL。用紫外分光光度计扫描蛋白的紫外吸收光谱，扫描速率为中速模式、波长为200 nm～360 nm、狭缝宽度为2 nm。取峰值变化最稳定的一组图谱。

1.2.7 内源性荧光光谱扫描

参照JIA等[20]的方法，并适当修改。3种蛋白分别溶于的磷酸盐缓冲液（pH8、0.2 mol/L）中，使蛋白浓度为0.1 mg/mL。用荧光光度计扫描蛋白的内源性荧光光谱图，将扫描发射光谱调为300 nm～400 nm、扫描速度为1 200 nm/min、电压为500 mV、激发波长和狭缝宽度均为5 nm。每组样品分别在280 nm的激发波长下进行3次扫描，取峰值变化最稳定的一组图谱。

1.2.8 热性质研究

参照张清安等[21]的方法，称取5 mg～8 mg蛋白粉置于氧化铝坩埚中，压力调节为0.03 MPa、保护气流设为20 mL/min、吹扫气流量设为60 mL/min，从30℃升温至800℃，加热速度选为10℃/min，进行热重分析和差示扫描量热分析。

1.2.9 Zeta电位测定

依据齐宝坤等[22]的方法，做适当修改。3种蛋白粉末比水更易溶于磷酸盐（pH7、0.2 mol/L）缓冲液中形成稳定体系，使蛋白浓度为0.1 mg/mL。使用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定，选取Zeta电位模式，每组Zeta电位分析运行20次，平行3组，根据测量结果进行分析。

1.2.10 粒径分布测定

使用Zeta电位分析中的备用待测蛋白溶液，同时将纳米粒径电位分析仪调至size模式，参数与Zeta电位模式相同，每组运行11次，平行3组，根据测量结果进行分析。

1.2.11 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

参考张君旗等[23]的方法，并作适当修改。采用13%的分离胶和5%的浓缩胶配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶。3种蛋白样品溶于pH7、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液中使其浓度达到0.25mg/mL，每种蛋白样品与加样缓冲液涡旋混匀后100℃加热3 min～5 min，因为加样缓冲液中含有还原剂β-巯基乙醇，所以在还原状态下进行测定。加样量为 20 μL，电泳缓冲液为 Tris-甘氨酸（0.125 mol/L Tris、1.25 mol/L甘氨酸、0.5%SDS），于25 mA下恒流进行。在浓缩胶中电压40 V、40 min后样液到达分离胶后升压至100 V，3 h电泳结束。电泳完毕凝胶置于0.25%考马斯亮蓝染色液中染色6 h后进行反复脱色并用凝胶成像系统进行成像处理。

1.2.12 色度值测定

按色差仪仪器要求采用白板进行零校准，取具有代表性样品，将样品摇匀后放入样品检测池进行测定。通过仪器软件读取样品的色泽指标L*为明度值；a*为红度值；b*为黄度值；ΔE为总色差值；C为饱和度；H为色调角。

1.3 数据处理

试验数据经Excel处理，采用Origin 2018软件绘图，采用统计软件SPSS 26.0进行显著性检验（P<0.05）分析。

2 结果与分析

2.1 吊干杏杏仁蛋白基本成分分析

吊干杏杏仁蛋白基本成分分析结果见表1。

表1 吊干杏杏仁蛋白基本成分分析Table 1 Analysis of basic components of dried apricot almond protein

由表1可知，3种蛋白的水分含量差异性显著（P＜0.05），大小依次为样品3＞样品2＞样品1。而3种蛋白的灰分含量差异性不显著（P＞0.05）。3种杏仁蛋白粉的蛋白质含量差异显著（P＜0.05），样品 1、2、3 蛋白质含量分别为75.73%、78.27%、72.09%。pH10条件下得到的蛋白质含量显著高于另外两种条件得到的蛋白质含量，原因可能是pH8提取的蛋白未充分从原料中溶出，而在pH12条件下由于碱性过强，从而影响了蛋白质含量。

2.2 表面疏水性分析

表面疏水性分析结果见图1。

图1 吊干杏杏仁蛋白表面疏水性Fig.1 Surface hydrophobicity of hanging dried almond protein

表面疏水性是蛋白质的疏水区域暴露在表面的程度。一些疏水性氨基酸从蛋白质分子内部暴露到外部，会促进蛋白质解折叠从而增加表面疏水性[24]。由图1可知，3种吊干杏杏仁蛋白中，与溴酚蓝结合量大小依次为样品3＞样品2＞样品1。溴酚蓝吸附测定时，蛋白与溴酚蓝结合量越多，表面疏水性就越高。结果表明在样品pH12与pH10下制备的杏仁蛋白表面疏水性差异不显著（P＞0.05），而pH12和pH10制备的杏仁蛋白其表面疏水性氨基酸含量均显著高于pH8制备的杏仁蛋白（P＜0.05），这可能是较高pH值容易使蛋白质的结构发生变化或被破坏，造成内部的疏水性基团暴露在外从而增加表面疏水性。

2.3 巯基含量分析

巯基含量分析见图2。

图2 吊干杏杏仁蛋白总巯基和游离巯基含量Fig.2 Content of total and free sulfhydryl groups in hanging dried apricot almond protein

巯基是蛋白质中的一种重要功能性基团，与蛋白质的生物活性、氧化程度以及蛋白变形程度息息相关[25]。由图2可知，3种吊干杏杏仁蛋白的总巯基和游离巯基含量大小依次为样品2＞样品1＞样品3。分析结果表明3种蛋白的总巯基含量差异性显著（P＜0.05），并且游离巯基含量差异也显著（P＜0.05）。很可能是提取过程中碱溶pH值条件的不同而导致各蛋白的总巯基含量和游离巯基含量产生差异。本研究与刘利格[26]的研究趋势相似，均为总巯基含量差异程度大于游离巯基含量差异程度，表明蛋白质均发生了不同程度地变性。在碱性环境下蛋白半胱氨酸中的巯基易被氧化形成二硫键，由图2可知，样品3的游离巯基/总巯基值最小，样品2次之，样品3与样品2无显著性差异（P＞0.05），表明样品3和样品2蛋白中大部分巯基形成二硫键，说明样品3和样品2相较于样品1蛋白质结构更趋于紧凑[19]。

2.4 羰基含量分析

羰基含量分析见图3。

图3 吊干杏杏仁蛋白羰基含量Fig.3 Content of carbonyl group in amygdalin of hanging dried apricot

由图3可知，样品3羰基含量最高，为（4.91±0.11）nmol/mg；样品 1羰基含量次之，为（4.09±0.16）nmol/mg；样品 2羰基含量最低，为（3.28±0.09）nmol/mg。羰基生成过程复杂，是由活性氧攻击氨基酸分子中自由氨基或亚氨基，经反应最终生成NH3和相应羰基衍生物[18]。因此蛋白羰基含量的高低可表明蛋白质被氧化的程度，3种蛋白的氧化程度差异显著（P＜0.05）。氧化原因可能是蛋白质在碱性或强碱性环境中发生不同程度地变性，使原本在蛋白内部的自由氨基或亚氨基等基团分子暴露出来而被氧化。

2.5 紫外光谱分析

紫外光谱分析结果见图4。

图4 吊干杏杏仁蛋白紫外光谱的二阶导数图谱Fig.4 Second derivative spectra of hanging dried apricot almond protein

在常见的蛋白质氨基酸中，酪氨酸（tyrosine，Tyr）、色氨酸（tryptophan，Trp） 和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）这3种芳香族氨基酸R基侧链含有芳香环，因其各自生色基团不同（Tyr具有羟苯基，Trp具有吲哚基，Phe具有苯基）而具有不同的紫外吸收光谱[22]。

蛋白质紫外光谱的二阶导数图谱相较原始图谱更能反映出对应波长的氨基酸含量。由图4可知，在280 nm～300 nm之间存在3个吸收峰，其中295 nm附近的峰值是由Trp残基决定，282 nm附近的峰值是由Tyr残基决定[19]。在295 nm附近样品2峰值最高，表明样品2蛋白表面的Trp残基含量最多。在282 nm样品3的峰值最高说明样品3蛋白表面的Tyr残基含量最多，而样品3在294 nm后Trp残基吸收峰有所下降，原因可能是在pH12的强碱性环境下使蛋白质内部更多的亲水性氨基酸Tyr残基暴露在蛋白表面而掩盖了蛋白质表面的疏水性氨基酸Trp，说明此时氨基酸环境向更加亲水的方向转移[27]。而样品2和样品1可能是提取过程中的碱性环境较弱，使得蛋白质的结构变化小，导致蛋白质内部的Tyr残基暴露在蛋白质表面的含量较低，由此推断蛋白质分子的构象。

2.6 荧光光谱分析

荧光光谱分析结果见图5。

在常见的蛋白质氨基酸中，具有芳香结构的氨基酸如Tyr、Trp和Phe为荧光物质分子。在280 nm条件下Tyr和Trp都产生荧光，但主要由Trp残基产生荧光。由图5可知，在280 nm的激发波长下3种蛋白最大吸收波长在325.8nm～330.8 nm之间无明显差异。当λmax＜330 nm时，Trp残基位于蛋白质的内部非极性区，由此说明3种蛋白的Trp残基所处微环境基本相似都为内部非极性区[28]。但3种蛋白的最大荧光强度大小依次为样品 2（1 520.6 cnt）＞样品 1（1 458.3 cnt）＞样品3（1 225.2 cnt）。所以3种蛋白Trp残基暴露数量由大到小依次为样品2＞样品1＞样品3。在280 nm激发波长下，样品1和样品2蛋白的最大荧光强度较为接近。蛋白的最大荧光强度间差异反映了蛋白质种类及其含量的不同，并且在折叠构象上也存在差异[20]。以上结果表明样品1与样品2所含蛋白种类及数量接近，构象相似。

图5 吊干杏杏仁蛋白在280 nm激发波长下的荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectrum of hanging dried almond protein at 280 nm excitation wavelength

2.7 热性质分析

2.7.1 热重分析

杏仁蛋白的热重分析曲线见图6。

图6 吊干杏杏仁蛋白的热重分析曲线Fig.6 Thermogravimetric analysis curve of dried apricot almond protein

由图6可知，吊干杏杏仁蛋白的热重曲线对温度的一阶导数（first derivative of a thermogravimetric curve withrespecttotemperature，DTG）分析曲线主要分3个阶段。第一阶段为30℃～200℃，主要是水分的蒸发而使其质量发生变化。第二阶段和第三阶段分别为201℃～501℃和501℃～800℃[25]。由图6 A可知，在第一阶段样品1分解发生明显变化，而其质量损失大部分在第二阶段，主要是蛋白质降解和碳水化合物降解所致。在326.81℃时失重率最高达30.69%，而在469.25℃失重率最低达55.08%。第三阶段的样品质量减轻是由于第二阶段的固体残留物缓慢分解，灼烧至只残留部分无机盐物质时到达终点。在620.94℃时最高失重率达75.46%。最终在771.01℃残留质量仅为4.35%。由图6 B可知，样品2的最大失重率在326.87℃和621.22℃，残留质量为3.96%。如图6 C样品3的最大失重率在316.65℃和630.94℃，残留质量为6.71%。

3种蛋白在同等参数条件下，样品3在第二阶段最大失重率最低，说明样品3此阶段热稳定性最好，依次为样品2、样品1。样品2残留质量最低，说明样品2无机盐含量最低。样品1与样品2的残留质量和第二阶段失重率接近，说明二者蛋白纯度接近，蛋白中蛋白种类较相似。而样品3残留质量最大，可能含有较多熔点高的无机盐分子。

2.7.2 差示扫描量热分析

差示扫描量热分析（differential scanning calorimetry analysis，DSC）通过蛋白质的热变性温度来评价蛋白质的热稳定性，通过蛋白质的热变性焓变值来评价蛋白质分子的空间结构有序性[24]。差示扫描量热分析曲线见图7。

图7 吊干杏杏仁杏仁蛋白DSC曲线Fig.7 DSC curve of amygdalin in hanging dried apricot almond

由图7 A可知，样品1的热变性温度为89.98℃，热变性温度峰值对应的峰面积值代表焓变值，为11.76J/g[24]。结合吊干杏杏仁蛋白的热重分析曲线，在89.98℃处于蛋白分解的第一阶段，大部分水分子蒸发，吸热开始逐渐分解。由图7 B与图7 C可知，样品2的热变性温度为90.21℃，焓变值为13.30 J/g；样品3的热变性温度为81.084℃，焓变值为10.28 J/g。热稳定性大小依次为样品2＞样品1＞样品3，3种蛋白的热变性温度差异较小，表明热稳定性3者较为接近。热变性温度峰值下对应的焓变值大小依次为样品2＞样品1＞样品3，与热变性温度大小顺序一致，表明在蛋白分解的第一阶段蛋白分子空间结构的有序性与热稳定性呈正相关。

2.8 Zeta电位分析

蛋白质表面氨基酸所带电荷的多少和电荷的正负性影响着蛋白质表面电位，从而影响了蛋白质溶液的Zeta电位值[29]。Zeta电位的大小能够很好的反映蛋白溶液分散体系的稳定性[22]。杏仁蛋白溶液的Zeta电位分析结果见图8。

图8 吊干杏杏仁蛋白的Zeta电位Fig.8 Zeta potential of hanging dried almond protein

由图8可知，样品1、样品2和样品3的电位值电势依次为-6.909 51、-13.543 28、-13.543 28 mV。3种蛋白Zeta电位值均为负值，表明蛋白表面带负电荷的氨基酸多于带正电荷的氨基酸；另一方面磷酸盐缓冲液pH值为7高于杏仁蛋白的等电点导致具有两性性质的蛋白分子吸附阴离子[30]。而蛋白溶液Zeta电位绝对值越大则分子表面同性电荷越多，蛋白溶液通过分子间静电斥力使溶液体系越稳定。3种蛋白其中样品3与样品2这两种蛋白的Zeta电位值相等，但样品3的电位分布值高于样品2，所以3种蛋白溶液体系的稳定性大小依次为样品3＞样品2＞样品1。造成这一现象原因可能是由于蛋白碱溶提取时pH值的不同使得到的蛋白中的蛋白种类和数量有较大差异，从而使暴露在蛋白质表面的亲水性氨基酸种类及数量产生差异。

2.9 粒径分布分析

3种蛋白溶液的粒径分布见图9。

由图9可知，3种蛋白的溶液粒径集中分布在200 nm～500 nm之间，样品1的粒径分布百分比最高，平均粒径尺寸为411.77 nm；样品2的粒径分布百分比最低，平均粒径尺寸为286.15 nm；样品3的粒径分布百分比率低于样品1，平均粒径尺寸为268.86 nm。此外样品2与样品3在5 nm～15 nm处也略有分布。

图9 吊干杏杏仁蛋白的粒径分布Fig.9 Particle size distribution of amygdalin in hanging dried apricot

蛋白质颗粒沉降速度与蛋白质之间的疏松程度、溶液的密度等有关，本试验3种蛋白密度一致，所以沉降速度相同，这为判断3种蛋白溶液体系的稳定性减少误差。DAY[31]研究发现乳液的粒径大小对乳液稳定性具有重要影响。此外也有研究发现蛋白质颗粒的粒径越小，系统的稳定性越高[32]。所以3种蛋白溶液体系的稳定性大小依次为样品3＞样品2＞样品1，与上述Zeta电位分析结果一致。

2.1 0 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可分开蛋白质，因此蛋白质的亚基迁移率主要取决于亚基分子量的大小[23]。3种蛋白亚基分子量分布见图10。

图10 吊干杏杏仁蛋白SDS-PAGE分析图谱Fig.10 SDS-PAGE analysis of hanging dried apricot almond protein

由图10可知，3种蛋白的亚基分子量大小主要集中在20 kDa和22 kDa两条条带。除此之外还包含颜色较浅的30、35、63 kDa条带。在20 kDa和22 kDa两条条带上，样品2较样品1的条带丰度更高，而样品3丰度最高。在30 kDa条带上浓度大小依次为样品3＞样品2＞样品1。在35 kDa条带上浓度大小依次为样品3＞样品2＞样品1。在63 kDa条带上3种蛋白条带丰度相近。综上所述样品3较于样品2和样品1在分子量20 kDa和22 kDa的亚基含量更多，在其他分子量上分布也最广。由此可以判断在pH值较高的碱性环境中提取蛋白时可能导致蛋白不同程度的变性，从而破坏蛋白质中的二硫键或肽键等作用力，导致其亚基分布较广，分子量更多地集中在20 kDa和22 kDa低分子量的多肽上。

2.1 1 色度分析

不同pH值提取的杏仁蛋白色度值的差异见表2。

表2 吊干杏杏仁蛋白色度值Table 2 Color value of hanging dried almond protein

由表2可知，3种蛋白L*值较高，表明蛋白较白、亮。但3种蛋白L*值差异不显著（P＞0.05），可能是蛋白分离物中都含有较多的淀粉等白色物质。3种蛋白a*值均为负数，表明3种蛋白颜色偏绿差异不显著（P＞0.05）；3种蛋白b*值均为正数，表明3种蛋白颜色偏黄。样品2和样品3较样品1显著（P＜0.05）；可能是提取时碱溶pH值较高蛋白更容易被氧化而造成的颜色偏黄。样品1蛋白的总色差ΔE显著高于其他两种样品蛋白（P＜0.05）。样品2的色调角显著高于其他两种蛋白（P＜0.05）。样品2与样品3色饱和度差异不显著（P＞0.05），可能是2种蛋白分离物中彩色物质的种类和数量接近造成的。综上所述，3种蛋白整体上为白色，在白色的基础上偏黄偏绿，且样品2和样品3在偏黄色上均显著高于样品1。

3 结论

在3种蛋白中样品3的表面疏水性、被氧化的程度、表面Tyr残基含量及蛋白溶液稳定性均最大。样品2表面Trp残基含量最多。热性质分析表明样品1与样品2在空间构象和蛋白种类及数量上较为相似，样品1和样品2都与样品3差异显著；3种蛋白热稳定性依次为样品2>样品1>样品3，且3种蛋白热稳定性接近；同时说明吊干杏杏仁蛋白变性温度较低，在加工此类产品时应合理控制温度以防止蛋白变性。凝胶电泳表示3种蛋白亚基含量主要集中在20 kDa和22 kDa，且样品3的丰度最高亚基分布最广。3种蛋白颜色在白色基础上偏黄偏绿，且样品2和样品3在偏黄色上均显著高于样品1。综上所述，不同pH值提取条件对于吊干杏杏仁蛋白的结构特性具有显著影响，这为吊干杏杏仁蛋白的进一步研究和应用提供了理论依据。