罗汉果皂苷改善糖尿病小鼠血糖的作用研究

黄盼玲，肖颖梅，李泊村，李和梅，蒋怡萱，夏星，3*

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.桂林市人民医院，广西 桂林 541000；3.广西高校中药药理重点实验室，广西 南宁 530200）

糖尿病是糖代谢紊乱导致血糖偏高的代谢性疾病。据国际糖尿病联盟（The International Diabetes Federation，IDF）公布数据显示，每年约有百万人死于糖尿病及其并发症，且将近一半为60岁以下人群[1]。糖尿病患者的胰岛素（insulin，INS）缺乏或者机体产生胰岛素抵抗，在葡萄糖摄入后形成血糖不能迅速被利用，引起体内血糖堆积，对机体各个器官造成慢性损伤。因此调节血糖的摄入和促进血糖分解代谢，是改善患者高血糖的关键途径。α-葡萄糖苷酶是位于小肠刷状缘细胞微绒毛的水解酶，参与并调节糖代谢过程，在Ⅱ型糖尿病的前期阶段，糖耐量异常时，抑制α-葡萄糖苷酶活性可减少餐后机体对食物糖分的摄取，抑制餐后血糖异常升高[2]，对糖尿病的防治有积极效果[3]。

罗汉果是葫芦科植物罗汉果 [Siraitia grosvenorii（Swingle）]的干燥果实[4]。分布于我国广西、广东、湖南等地，性凉、味甘，具有清肺利咽、化痰止咳的功效，是常见的药食同源食品[5]。现代人饮食结构中碳水摄入过多，易引起肥胖、糖尿病等一系列健康问题。罗汉果甜味来源罗汉果皂苷，因具有甜度高、无毒性、低卡路里、不引起血糖升高等特点成为理想的非糖类替代甜味剂[6]。研究表明，罗汉果皂苷能显著降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG），调节糖尿病小鼠餐后血糖异常[7]。并且罗汉果皂苷能调节妊娠糖尿病大鼠血糖血脂紊乱，缓解胰腺组织氧化应激损伤[8]。何超文等[9]还发现罗汉果苷在体外对α-葡萄糖苷酶活性具有直接的抑制作用，表明罗汉果皂苷可能抑制肠道α-葡萄糖苷酶活力，减缓肠道对葡萄糖的吸收，起到降低餐后血糖的作用。前期研究证实罗汉果皂苷对Caco2细胞的α-葡萄糖苷酶活性具有显著抑制作用，并与剂量呈正相关[10]。但是罗汉果皂苷在体内是否有与体外一致的抑制α-葡萄糖苷酶作用，且其对血糖控制相关内分泌激素的影响尚不明确，为进一步探明罗汉果皂苷对动物血糖代谢的影响，本研究观察了罗汉果皂苷对正常小鼠和糖尿病小鼠α-葡萄糖苷酶的作用，以及其对重要的血糖调节因子INS和胰高血糖素样肽的影响，为罗汉果及其衍生产品的应用与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

罗汉果皂苷：桂林实力科技有限责任公司；胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）ELISA试剂盒、INS ELISA试剂盒：武汉华美生物工程有限公司；链脲佐菌素（streptozocin，STZ）、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）：美国SIGMA-ALDRICH公司；盐酸吡格列酮片：四川迪康科技药业股份有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物技术研究所；高脂饲料（基础饲料74.5%、胆固醇1%、蛋白粉5%、蔗糖10%、猪油9%、胆酸钠0.5%）：广西中医药研究院制。

三诺安稳（调码型）血糖测试仪：长沙三诺生物传感技术股份有限公司；SQP型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HVE-50高压灭菌锅：日本HiraYama公司；Aqualix-5纯水仪：默克密理博实验室设备（上海）有限公司；EPOCH全波长酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；UV-1800紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.2 实验动物

昆明种小鼠，全雄，18 g～22 g，4周龄左右：湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004，No.43004700009905。饲养于广西中医药大学实验动物中心。

1.3 糖尿病模型建立

雄性KM小鼠以高脂饲料连续喂养4周。第29天，小鼠禁食不禁水12h后，腹腔注射柠檬酸缓冲液配制的STZ100mg/kg造模，另取正常小鼠采用相同方式注射溶剂柠檬酸盐缓冲液，造模后第3天禁食12 h，测定FBG，血糖大于11 mmol/L的小鼠即认为造模成功[11]。

1.4 分组和处理

为观察罗汉果皂苷对糖尿病模型动物肠道α-葡萄糖苷酶活性、血糖和血糖调节因子的影响，取造模成功的小鼠随机分为模型组、吡格列酮组（2.57 mg/kg）、罗汉果皂苷高剂量组（200.00 mg/kg）、罗汉果皂苷低剂量组（100.00 mg/kg），取正常小鼠设置为空白组。空白组和模型组灌胃蒸馏水，其余各组灌胃相应药物，每日1次，同时糖尿病造模动物持续以高脂饲料喂养，连续3周，每周测量一次FBG。为观察罗汉果皂苷对正常动物肠道α-葡萄糖苷酶活性的影响，正常动物服用罗汉果皂苷高剂量（200.00 mg/kg）及罗汉果皂苷低剂量（100.00 mg/kg），灌胃1周。

1.5 口服糖耐量（oral glucose tolerance test，OGTT）检测

小鼠灌胃第23天，测量小鼠FBG值作为0时血糖，再对小鼠灌胃给予淀粉作为糖源（2 g/kg），测量灌胃后30、60、120 min时血糖值，以灌胃后时间为横坐标，血糖值为纵坐标绘制血糖曲线，并用GraphPad软件计算血糖曲线所覆盖的面积，为血糖曲线下面积（area under curve，AUC），代表动物的糖耐量水平[12]。

1.6 肠组织α-葡萄糖苷酶活性检测

按照1.4的分组处理，为观察罗汉果皂苷对正常小鼠肠道α-葡萄糖苷酶的影响，灌胃1周后处死罗汉果皂苷高剂量组和低剂量组的正常小鼠，取小肠组织。为观察在糖尿病模型中罗汉果皂苷对α-葡萄糖苷酶的影响，连续灌胃罗汉果皂苷3周，观察到对血糖的控制效果后，处死空白组小鼠、模型组小鼠、吡格列酮组小鼠、罗汉果皂苷高、低剂量组小鼠，取小肠组织检测α-葡萄糖苷酶活力。具体做法为末次灌胃后1 h，脱颈椎处死小鼠，取小肠中段肠组织剪碎，按体重质量比 1∶9加入预冷的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）缓冲液匀浆，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清，依照试剂盒说明，进行α-葡萄糖苷酶活性测定。小肠酶提取液与PBS缓冲液、PNPG混合，置于37℃温育箱中反应15 min，用酶标仪检测405 nm处OD值，酶活力单位定义为37℃下每反应15 min，吸光度值增加1即为1个活力单位（U），根据以下公式计算单位蛋白量下的α-葡萄糖苷酶活力。

1.7 血浆INS与GLP-1水平检测

为观察在糖尿病模型中罗汉果皂苷对关键的血糖调节因子的影响，末次灌胃1h后，对空白组小鼠、模型组小鼠、吡格列酮组小鼠、罗汉果皂苷高、低剂量组小鼠进行眼眶后静脉丛取血，肝素抗凝，4℃、3 500 r/min离心15 min取上清，进行INS与GLP-1水平检测，分别按照小鼠INS酶联免疫法试剂盒及小鼠GLP-1酶联免疫试剂盒要求进行检测操作，用全波长酶标仪在450 nm波长处测量OD值，计算出血浆中INS和GLP-1的浓度。

1.8 数据统计分析

结果以平均值±标准差表示，用GraphPad Prism软件进行统计分析，采用t检验方法比较组间差异，P<0.05表明差异显著。

2 结果与分析

2.1 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠FBG水平的影响

罗汉果皂苷对糖尿病小鼠FBG的影响结果见表1。

表1 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠FBG的影响（±s，n=10）Table 1 Effect of mogroside on FBG in diabetic mice（±s，n=10）

表1 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠FBG的影响（±s，n=10）Table 1 Effect of mogroside on FBG in diabetic mice（±s，n=10）

注：与空白组比较，##表示差异极显著（P<0.01）；与模型组比较，**表示差异极显著（P<0.01）。

组别FBG/（mmol/L）0 d 7 d 14 d 21 d空白组 5.08±1.19 4.23±1.03 4.76±0.89 5.52±1.20模型组 18.07±3.48##23.87±2.72##20.58±5.28##22.22±2.15##吡格列酮组 18.03±3.99 23.17±3.84 19.57±8.06 15.58±5.32**罗汉果皂苷高剂量组17.94±3.87 22.04±6.70 23.01±2.80 16.87±4.20**罗汉果皂苷低剂量组17.99±3.82 23.99±4.59 23.20±2.85 16.23±6.04**

由表1可知，首次给药前，糖尿病造模小鼠的FBG皆高于11 mmol/L，并出现进食饮水增加、排尿增加、体重下降、精神萎靡、皮毛晦暗的现象，表明糖尿病模型比较稳定。给药期间，吡格列酮组小鼠在治疗14 d后FBG开始出现下降趋势。21 d时，吡格列酮组、罗汉果皂苷高、低剂量组小鼠FBG值较模型组极显著下降（P<0.01），吡格列酮组虽然低于罗汉果皂苷组FBG，但无统计学意义，表明罗汉果皂苷能改善糖尿病小鼠糖代谢能力，具有显著的降血糖作用。

2.2 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活力的影响

罗汉果皂苷对糖尿病小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活力的影响结果见表2。

表2 罗汉果皂苷对小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活力的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of mogroside on intestinal α-glucosidase activity in mice（±s，n=10）

表2 罗汉果皂苷对小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活力的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of mogroside on intestinal α-glucosidase activity in mice（±s，n=10）

注：与空白组比较，##表示差异极显著（P<0.01）；与模型组比较，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。

α-葡萄糖苷酶活力/（U/mg protein）正常小鼠 空白组 76.70±15.21罗汉果皂苷高剂量组 200.00 69.28±23.02罗汉果皂苷低剂量组 100.00 79.12±15.07糖尿病小鼠 模型组 175.39±30.20##吡格列酮组 2.57 207.59±28.09罗汉果皂苷高剂量组 200.00 129.09±30.85**罗汉果皂苷低剂量组 100.00 133.11±44.28*动物类型 组别 剂量/（mg/kg）

由表2可知，正常小鼠罗汉果皂苷高、低剂量组的肠道α-葡萄糖苷酶活力与空白组相近，无显著性差异，表明罗汉果皂苷对正常小鼠小肠α-葡萄糖苷酶活力无明显的影响。在糖尿病动物中，模型组小鼠肠道中α-葡萄糖苷酶活性极显著升高（P<0.01），罗汉果皂苷高、低剂量都能下降糖尿病小鼠小肠α-葡萄糖苷酶的活力，与模型组比较有显著差异（P<0.01，P<0.05），该结果表明罗汉果皂苷对糖代谢异常小鼠异常升高的α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用。

2.3 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠OGTT的影响

罗汉果皂苷对糖尿病小鼠OGTT的影响结果见表3。

表3 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠OGTT的影响（±s，n=10）Table 3 Effect of mogroside on OGTT in diabetic mice（±s，n=10）

表3 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠OGTT的影响（±s，n=10）Table 3 Effect of mogroside on OGTT in diabetic mice（±s，n=10）

注：与空白组比较，##表示差异极显著（P<0.01）；与模型组比较，*表示差异显著（P<0.05），**表示差异极显著（P<0.01）。

血糖值/（mmol/L）AUC/（min·mmol/L）0 min 30 min 60 min 120 min空白组 4.44±1.04 6.07±2.40 4.49±1.01 4.19±1.09 508.65±141.36模型组 19.25±2.65## 22.25±3.78## 23.59±3.43## 22.50±2.93## 2 692.875±213.09##吡格列酮组 10.75±3.29 20.92±5.12 21.03±5.42 16.77±7.84 2 238.45±577.65罗汉果皂苷高剂量组 9.02±3.16** 18.31±6.20 16.62±6.07* 12.82±7.07** 1 817.2±665.52**罗汉果皂苷低剂量组 7.96±4.44** 20.33±5.77 19.15±7.25 14.28±8.00* 2 084.53±770.87*组别

由表3可知，所有小鼠在灌胃淀粉后，血糖水平均增高，在30 min时空白组与罗汉果皂苷高剂量组小鼠血糖值达到最高值；60 min时，空白组与罗汉果皂苷高剂量组血糖值开始下降，与模型组比较具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。模型组与吡格列酮组的血糖值60 min时达到峰值，120 min时模型组血糖值仍处于较高水平，可见糖尿病小鼠抑制餐后血糖上升的能力较差，吡格列酮组餐后血糖虽有明显下降，但与模型组比较无显著性差异（P>0.05）。计算每组各时间点血糖值曲线下面积AUC，结果表明，罗汉果皂苷高、低剂量组AUC较模型组显著下降（P<0.01，P<0.05）。可见经罗汉果皂苷干预后，糖尿病小鼠的餐后血糖调控能力得到改善。

2.4 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠血浆GLP-1及INS的影响

罗汉果皂苷对糖尿病小鼠血浆GLP-1及INS的影响结果见表4。

表4 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠血浆中INS和GLP-1的影响（±s，n=10）Table 4 Effect of mogroside on INS and GLP-1 in diabetic mice（±s，n=10）

表4 罗汉果皂苷对糖尿病小鼠血浆中INS和GLP-1的影响（±s，n=10）Table 4 Effect of mogroside on INS and GLP-1 in diabetic mice（±s，n=10）

注：与空白组比较，##表示差异极显著（P<0.01）；与模型组比较，**表示差异极显著（P<0.01）。

组别INS/（IU/mL）GLP-1/（pg/mL）空白组 17 972.81±2 331.25 85.256±9.624模型组 8 165.63±1 685.39## 64.216±10.383##吡格列酮组 8 964.16±2 241.08 73.016±26.681罗汉果皂苷高剂量组 11 343.17±1 796.10** 93.433±19.374**罗汉果皂苷低剂量组 8 770.42±1 409.37 83.534±7.244**

由表4可知，与空白组比较，糖尿病模型组小鼠血浆INS与GLP-1含量极显著减少（P<0.01），通过罗汉果皂苷干预后，与模型组比较，高、低剂量组小鼠血浆中GLP-1极显著升高（P<0.01），并且高剂量组小鼠血浆中INS水平明显提高（P<0.01）。说明罗汉果皂苷能促进肠道生成GLP-1和INS分泌。

3 讨论

α-葡萄糖苷酶能催化小肠内的麦芽糖、蔗糖等水解，抑制其活性可减慢碳水化合物分解为葡萄糖的速度[13]。α-葡萄糖苷酶抑制剂（α-glucosidase inhibitor，AGI）主要从干预糖耐量受损方面调节糖代谢，通过减缓餐后血糖上升，减少饮食葡萄糖对胰腺的刺激，保护机体INS敏感性，且不影响基础血糖，故不会引起低血糖等副作用[14]。市面上常用α-葡萄糖苷酶抑制剂有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，但也存在一些不足，因其降糖作用单一，常要与其他降糖药物联用，不良反应包括胃肠系统紊乱会出现胃胀、腹胀、腹泻、胃肠痉挛性疼痛等[15]。研究发现，从一些天然产物提取的例如黄酮[16]、多糖[17]、皂苷[18]等，具有显著抑制 α-葡萄糖苷酶作用，是开发更安全、副作用更低的新型AGI的重要方向。

前期研究发现，一定浓度的罗汉果皂苷能抑制Caco2细胞α-葡萄糖苷酶活力，进一步开展体内实验，STZ联合高脂饮食造2型糖尿病模型，证明罗汉果皂苷对正常小鼠α-葡萄糖苷酶活性无明显抑制作用，却能抑制糖尿病小鼠α-葡萄糖苷酶活性。对于糖代谢正常的机体，肠道α-葡萄糖苷酶活性过低会影响机体的正常食物吸收过程，而不影响正常机体肠道α-葡萄糖苷酶活性的罗汉果皂苷，不会在进食后引起血糖补充。实验检测糖尿病小鼠OGTT，结果显示模型组小鼠进食淀粉2 h内血糖持续升高，自身对高血糖几乎没有调控作用，经罗汉果皂苷作用糖尿病小鼠的OGTT显著降低。研究发现90 d生长期罗汉果提取物显著降低了小鼠血糖应答曲线下面积，这与本研究中糖尿病小鼠食用罗汉果皂苷后糖耐量水平得到改善是一致的[19]。研究表明罗汉果皂苷对餐后血糖的生成有抑制作用。本研究中发现的罗汉果皂苷直接抑制糖尿病小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活力的作用，可能是其改善糖尿病小鼠餐后血糖调节能力的直接原因。

研究表明α-葡萄糖苷酶活性降低，导致小肠内碳水化合物浓度增加，刺激小肠L细胞分泌GLP-1，GLP-1是一种肠促胰素分泌剂，能与胰腺β细胞表面G蛋白偶联受体GLP-1R结合并激活，引起环磷酸腺苷与细胞内钙水平升高，刺激葡萄糖依赖性INS释放[20]。研究表明，STZ联合高脂饮食引起糖尿病小鼠INS合成障碍，INS含量降低，在高、低剂量罗汉果皂苷的干预下，糖尿病小鼠血浆中GLP-1水平随给药剂量增大而增大，相应的INS水平也逐渐增加。提示罗汉果皂苷有可能通过抑制肠道α-葡萄糖苷酶活性，刺激GLP-1分泌，促进INS释放调节机体血糖。此外，研究表明GLP-1还具有多项调节作用，抑制胰岛β细胞凋亡、促进胰岛β细胞增殖和新生等[21]。体外实验发现，罗汉果皂苷能抑制高脂高糖损伤的胰岛INS-1细胞caspase 3凋亡通路的激活[22]。李宝铜等[23]通过罗汉果皂苷干预改善糖尿病大鼠胰岛细胞变形萎缩，并且增加胰岛细胞数量。这些药理作用都有可能与罗汉果皂苷刺激肠道GLP-1分泌有关，机制如何还有待进一步研究。

4 结论

研究表明罗汉果皂苷对高脂饲料喂养联合STZ所致的糖尿病小鼠具有显著的降血糖作用。罗汉果皂苷能抑制糖尿病动物肠道α-葡萄糖苷酶活性，但不影响正常动物肠道α-葡萄糖苷酶活性，能改善糖尿病小鼠OGTT，提高糖尿病小鼠的餐后血糖调节能力。此外，罗汉果皂苷能增加内源性GLP-1和INS分泌。罗汉果皂苷甜度高，食用后不会引起血糖升高，并且通过影响肠道α-葡萄糖苷酶活性及GLP-1的分泌，来降低糖尿病动物血糖水平。由此可见，罗汉果皂苷用于糖尿病治疗的潜力较大，亦有利于应用在保健食品的开发上，后期可通过研究GLP-1分泌相关途径进一步研究罗汉果皂苷降血糖的作用机制。