一测多评法测定升提颗粒中8种成分的含量

毕 夏，迟 静，刘志民，刘德军

1. 辽宁中医药大学附属第三医院临床药学，沈阳 110003；2. 辽宁中医药大学附属第三医院制剂中心，沈阳 110003；3. 东北制药集团股份有限公司，沈阳 110026

升提颗粒在临床主要用于气虚下陷、劳伤虚损所致的胃下垂、子宫下垂和脱肛等症的治疗，由党参、黄芪、枳壳、白术和升麻5味中药经提取并加入适量辅料制备而成。方中黄芪补气升阳、生津养血，为君药；健脾益肺的党参和健脾益气的白术为臣药；理气宽中、行滞消胀的枳壳为佐药；使药升麻入脾经、胃经，升举脾胃清阳之气。诸药合奏，共达升阳益气之功效。升提颗粒质量标准WS-10891(ZD-0891)-2002[1]收载于国家药品标准，仅对枳壳所含柚皮苷进行定量检测，由于中药材及其制剂所含成分复杂多样，多种成分共同作用，仅检测1种成分不能全面控制产品的内在质量，多种指标评价方式已越来越多地应用于中药及其制剂的质量监控中，但传统的多种指标评价方式存在对照品用量大、检验费用较高、个别对照品不易获取及易分解或降解等缺点。一测多评法(quantitative analysis of multi-components with single-marker, QAMS)[2]建立其他成分与内参物间的相对校正因子(relativecorrection factor, RCF)，利用内参物含量和RCF计算其他成分的含量，实现对中药材及其制剂多种指标的同步检测、分析，QAMS越来越多地应用于中药材[3]和中药制剂[4]的质量监控中。本实验采用高效液相QAMS，以升提颗粒方中君药黄芪、臣药党参及佐药枳壳为研究对象，对它们所含的成分进行分析，以黄芪所含的主要特征性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素，党参所含的主要活性成分党参炔苷和紫丁香苷以及枳壳所含的主要活性成分芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷为分析指标，同时选取价廉易得、质量稳定的毛蕊异黄酮葡萄糖苷为内参物，建立了升提颗粒中8种指标成分的同步定量分析方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；CPA225D型电子分析天平(德国Sartorius公司)；CH-250型超声波清洗器(北京创新德超声电子研究所)；Agilent HC-C18液相反相柱(上海洽姆仪器科技有限公司)；Nucleodur C18液相反相柱(北京英莱克科技发展有限公司)；Kromasil C18液相反相柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，上海洽姆仪器科技有限公司)。

1.2 试药

对照品紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷(批号依次为111574-201605、111920-201907、110722-201815、110721-202019和111857-201804，质量分数依次为95.2%、96.8%、91.7%、95.3%和99.4%)，均购自中国食品药品检定研究院；对照品党参炔苷、芒柄花素和芸香柚皮苷(批号依次为PRF9121002、PRF8091225和PRF9062802，质量分数依次为99.9%、99.9%和99.8%)均购自成都普瑞法科技开发有限公司；升提颗粒分别购自金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂(批号200419、200601和200812)和南京恒生制药有限公司(批号09200601、09200902和09200905)，规格为每袋装10 g；乙腈为色谱级(批号188670，美国Fisher公司)；水为纯净水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选用Agilent HC-C18液相色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。柱温设定为30 ℃。流动相为乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水溶液(B)。流速为1.0 mL·min-1。梯度洗脱(0～10 min，17.0%A；10～25 min，17.0%→50.0%A；25～50 min，50.0%A→80.0%A；50～60 min，80.0%A→17.0%A)。波长切换：0～25 min在254 nm处测定党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素[5-16]，25～60 min在283 nm处测定芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷[17-21]。进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷对照品，加甲醇制成质量浓度分别为0.598、0.106、0.272、0.418、0.974、4.890、0.362和2.508 mg·mL-1的储备液。精密吸取上述储备液2.5 mL，用甲醇稀释20倍制成对照品溶液(党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的质量浓度依次为29.9、5.3、13.6、20.9、48.7、244.5、18.1和125.4 μg·mL-1)。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称取升提颗粒细粉2.0 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷并用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，续滤液即为升提颗粒供试品溶液。按照升提颗粒质量标准中的处方工艺分别制备缺少党参、缺少黄芪、缺少枳壳的阴性样品适量，再按照升提颗粒供试品溶液制备步骤制成党参阴性供试品溶液、黄芪阴性供试品溶液和枳壳阴性供试品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1系统适用性考察 精密吸取对照品溶液和供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，见图1。升提颗粒中党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷与相邻峰的分离度均符合要求(>1.5)；理论板数以目标成分色谱峰计均>6 000；党参阴性供试品溶液、黄芪阴性供试品溶液和枳壳阴性供试品溶液对指标成分的检测无干扰。

注：A.混合对照品溶液；B.升提颗粒供试品溶液；C.党参阴性溶液；D.黄芪阴性溶液；E.枳壳阴性溶液；1.党参炔苷；2.紫丁香苷；3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；4.芒柄花素；5.芸香柚皮苷；6.柚皮苷；7.橙皮苷；8.新橙皮苷。

2.3.2线性关系及RCF考察 精密吸取2.2.1项下对照品储备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，稀释制得6个系列质量浓度的对照品溶液，依法进样检测，以对照品党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积为纵坐标(y)，以质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)，进行回归，见表1；以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为内参物，建立其与党参炔苷、紫丁香苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷间的RCFs，见表2。fk/s=fk/fs=(Ck×As)/(Cs×Ak)(其中f、C和A分别表示RCF、质量浓度和峰面积，k和s分别表示其他待测成分和内参物)。

2.3.3精密度考察 吸取2.2.1项下对照品溶液连续进样6次，计算得党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰的相对峰面积(relative standard deviation，RSD)分别为1.18%、1.30%、1.21%、1.04%、0.99%、0.56%、1.10%、0.67%，表明仪器精密度良好。

表1 升提颗粒中党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的回归方程、线性范围和相关系数

2.3.4稳定性考察 取1份升提颗粒(批号200419)供试品溶液，于制备0、2、5、9、14和24 h分别进样进行检测，计算得升提颗粒供试品溶液中党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰的RSD值分别为1.27%、1.36%、1.29%、1.11%、1.06%、0.72%、1.23%、0.75%，表明供试品溶液于制备后24 h内稳定。

2.3.5重复性考察 精密称取升提颗粒(批号200419)样品6份制备供试品溶液并进样进行检测分析，计算得党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的RSD值依次为1.60%、1.87%、1.81%、1.75%、1.69%、1.02%、1.58%、1.35%。

2.3.6加样回收率考察 精密称取已知党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的升提颗粒(批号200419)1.0 g各9份，每组分别精密加入混合对照品溶液(党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的质量浓度分别为0.392、0.049、0.153、0.272、0.531、3.181、0.216、1.712 mg·mL-1)0.8、1.0和1.2 mL，再按2.2.2项下方法处理得加样供试品溶液，进样检测，结果党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的平均加样回收率(RSD值)分别为99.02%(0.58%)、98.13%(1.46%)、99.35%(1.51%)、96.78%(1.40%)、99.39%(0.76%)、100.08%(0.62%)、97.71%(1.27%)、99.36%(0.85%)。

表2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷对党参炔苷、紫丁香苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的RCFs

2.4 相对校正因子耐用性考察及各种成分色谱峰定位

2.4.1仪器和色谱柱 精密吸取2.2.1项下对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，对比考察了Agilent 1260型及Waters 2695型高效液相色谱仪，Agilent HC-C18、Nucleodur C18和Kromasil C18色谱柱(规格均为4.6 mm×250 mm，5 μm)对RCFs的影响。结果见表3。

表3 不同仪器、色谱柱对RCFs的影响

2.4.2流速 精密吸取2.2.1项下对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，分别考察了不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1)对RCFs的影响。结果见表4。

2.4.3柱温 精密吸取2.2.1项下对照品溶液，在2.1项色谱条件下进样分析，分别考察了不同柱温(28、29、30、31、32 ℃)对RCFs的影响。结果见表5。

2.4.4目标化合物色谱峰的定位 考察相对保留时间值(其他目标化合物与内参物毛蕊异黄酮葡萄糖苷保留时间的比值)在不同仪器和不同品牌色谱柱条件下的重复性，对目标化合物进行色谱峰定位。结果见表6。

2.5 QAMS与外标法测定结果的对比

取3批升提颗粒样品，分别按2.2.2项下方法处理制得升提颗粒供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析，采用外标法(external standard method, ESM)和QAMS计算各成分的含量。结果见表7。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

为使待检测的党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷得到良好的分离，本实验重点考察了流动相乙腈-水[5-6,9-11]、乙腈-1 mL·L-1甲酸水溶液[7,19-20]、乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液[8,17-18]，结果显示，用乙腈-水洗脱时，紫丁香苷含量因基线漂移无法正常检测；用乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液洗脱时，柚皮苷色谱峰出现拖尾现象，无法准确积分。综合色谱图中基线噪音、目标成分分离度、色谱峰形等因素，最终采用乙腈-1 mL·L-1甲酸水溶液[7,19-20]作为流动相。

表4 不同流速对RCFs的影响

表5 不同柱温对RCFs的影响

表6 不同仪器、色谱柱对相对保留时间值的影响

3.2 提取方法的选择

在制备升提颗粒供试品溶液时，以党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷综合提取率为指标，同时考虑杂质干扰造成的影响，首先对提取溶剂(体积分数为70%的乙醇[5]、体积分数为95%的乙醇[11]、甲醇[6-7]、体积分数为75%的甲醇[8]和体积分数为50%的甲醇[9])进行了对比考察。结果见表8和图2。结果显示，以甲醇为提取溶剂时，8种成分含量相对较高，含量总和最高，故选取甲醇为提取溶剂。继而对不同的提取方式(超声提取和加热回流提取)和提取时间(20、30、40和50 min)进行了摸索，最终确定使用甲醇超声处理30 min制备升提颗粒供试品溶液。

表7 QAMS与ESM测得升提颗粒中各活性成分的含量 (n=3)

表8 提取溶剂对8种成分含量的影响

注：A. 体积分数70%乙醇；B. 体积分数95%乙醇；C. 甲醇；D. 体积分数75%甲醇；E. 体积分数50%甲醇；1. 党参炔苷；2.紫丁香苷；3. 毛蕊异黄酮葡萄糖苷；4. 芒柄花素；5. 芸香柚皮苷；6. 柚皮苷；7. 橙皮苷；8. 新橙皮苷。

本实验建立了升提颗粒中党参炔苷、紫丁香苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的同步检测方法。该方法简单易操作、结果准确、重复性好，可为完善升提颗粒的质量标准、确保该药品的质量提供依据。