一测多评法评价川射干配方颗粒的质量

梅国荣，徐红应，黄 宇，黄美华，陈 蓉，周靖惟,2，胡昌江,2，孙纪元*

1. 四川新绿色药业科技发展有限公司，国家中医药管理局中药配方颗粒质量与疗效评价重点实验室，成都 611900；2. 成都中医药大学，成都 611137

川射干为鸢尾科植物鸢尾(IristectorumMaxim.)的干燥根茎，具有清热解毒、祛痰、利咽的功效，用于治疗热毒痰火郁结、咽喉肿痛、痰涎壅盛、咳嗽气喘[1]。川射干配方颗粒是以川射干饮片为原料，经提取、浓缩、干燥、制粒、包装制成的单味颗粒。川射干的化学成分主要为黄酮类、异黄酮类、苯醌类及酚类化合物[2-4]，其中异黄酮类化合物是鸢尾科植物的特征性化学成分，具有抗炎、解热、止咳、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、保护神经等作用[5-11]。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版一部仅对川射干中射干苷的含量进行了控制，未能反映其他异黄酮类成分的含量水平。王智民等[12]提出的一测多评法(quantitative analysis of multi-components with single-marker, QAMS)的多指标质控模式符合中药化学成分复杂的特点，即在进行多指标质量控制时，以样品中廉价易得的典型成分为内标，建立该成分与其他成分间的相对校正因子(fk/s)，再通过fk/s计算其他成分的含量，从而实现多成分的同时评价，此方法在实践中得到了广泛应用，取得了较好的效果[12-21]。目前《中国药典》2020年版一部使用QAMS对丹参、黄连等药材进行质量控制[1]。为全面控制川射干配方颗粒的质量，本研究采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立了测定5种异黄酮类成分含量的QAMS。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 5 TC-C18色谱柱(安捷伦股份有限公司)、YMC-Tiart C18(YMC 股份有限公司)、WondaSil C18(日本岛津公司)；Agilent 1260液相色谱仪(安捷伦股份有限公司)；Wsters e2695液相色谱仪(沃特世科技有限公司)；XPE26百万分之一天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司)；ME204E万分之一天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司)；Mocell 1820A制水机(重庆摩尔水处理设备有限公司)；KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

射干苷(批号111632-202003，质量分数98.7%，中国食品药品检定研究院)；野鸢尾苷(批号wkq18010404，质量分数98.1%)，鸢尾黄素(批号wkq1802201，质量分数98.2%)，鸢尾甲黄素A(批号wkq18052903，质量分数97.3%)，鸢尾甲黄素B(批号wkq18021107，质量分数98.0%)，均购自维克奇生物科技有限公司；乙腈(Sigma-Aldrich贸易有限公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

川射干配方颗粒(批号分别为1608062、1708001、1803049、1806001、1901001，四川新绿色药业科技发展有限公司)。

2 方法与结果

2.1 HPLC方法的建立

2.1.1色谱条件 色谱柱为Agilent 5 TC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。以乙腈为流动相A，2 mL·L-1磷酸水溶液为流动相B。梯度洗脱：0～30 min，18% A；30～40 min，18%A～25%A；40～45 min，25%A～38% A；45～60 min，38%A。流速为0.9 mL·min-1。检测波长为265 nm。柱温为40 ℃。结果见图1。

2.1.2混合对照品溶液的制备 分别取射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾加黄素B适量，精密称定，加体积分数为70%的乙醇制成含射干苷403.56 μg·mL-1、野鸢尾苷74.754 μg·mL-1、鸢尾黄素200.312 μg·mL-1、鸢尾甲黄素A 59.247 6 μg·mL-1、鸢尾甲黄素B 104.664 μg·mL-1的溶液，作为混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液5 mL转移至25 mL量瓶中，用体积分数为70%的乙醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.1.3供试品溶液的制备 精密称定川射干配方颗粒0.2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70%的乙醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用体积分数为70%的乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

注：a.对照品；b.供试品；1.射干苷；2.野鸢尾苷；3.鸢尾黄素；4.鸢尾甲黄素A；5.鸢尾甲黄素B。

2.1.4线性关系考察 取混合对照品储备液分别稀释0、2、5、10、25、50倍，分别制成标准曲线溶液Ⅰ～Ⅵ，分别取10 μL，按2.1.1项下色谱条件测定，以对照品进样量为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归，结果见表1。

表1 5种成分线性关系考察结果

2.1.5精密度实验 取混合对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，记录各成分的峰面积并计算峰面积的RSD值，射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B峰面积的RSD值分别为0.46%、0.52%、0.65%、0.63%和0.68%，表明仪器的精密度良好。

2.1.6重复性实验 取同一批号(批号1806001)川射干配方颗粒供试品，按2.1.3项下方法制备6份供试品溶液，进样分析，记录各成分的峰面积，用外标法(external standard method，ESM)计算各成分的含量和含量的RSD值。计算得射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B的含量分别为29.97、2.50、12.69、1.23、3.26 mg·g-1，样品中以上5种成分的含量均在标准曲线范围内；RSD值分别为0.56%、0.92%、0.69%、0.86%、0.67%，表明方法的重复性良好。

2.1.7稳定性实验 取同一批号(批号1806001)川射干配方颗粒供试品，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，记录各成分的峰面积和峰面积的RSD值。计算得射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B峰面积的RSD值分别为0.25%、0.93%、0.07%、0.28%、0.09%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8准确度实验 精密称取已知5种成分含量的川射干配方颗粒供试品(批号1806001)0.1 g，精密称定6份，加入混合对照品储备液5 mL，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，进样分析。计算得射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B的平均加样回收率分别为97.58%、94.32%、97.81%、98.34%、95.67%，RSD值分别为2.22%、1.57%、2.41%、1.89%、0.96%，表明该方法的准确度良好。

2.2 相对校正因子确定

2.2.1相对校正因子计算 取标准曲线溶液Ⅰ～Ⅵ 10 μL，进样分析，记录各成分的峰面积，选择射干苷为内参物确定其他成分的fk/s，结果见表2。

表2 相对校正因子的计算

2.2.2重复性考察 考察了采用不同色谱系统(Agilent 1260和Waters e2695)及不同色谱柱(Agilent 5 TC C18250 mm×4.6 mm，5 μm；YMC C18250 mm×4.6 mm，5 μm；Wondasil C18250 mm×4.6 mm，5 μm)对fk/s的影响，结果见表3。结果显示，各待测成分fk/s使用不同色谱系统、不同色谱柱时重复性较好。

表3 不同色谱系统、不同色谱柱对fk/s的影响

2.2.3QAMS待测成分定位 通过相对保留时间对待测化合物进行定位，以射干苷保留时间为参照，分别考察相对保留时间在不同色谱系统和不同色谱柱的重复性，结果见表4。结果表明，各待测成分相对保留时间在使用不同色谱系统、不同色谱柱时差异较小，可用于待测组分的定位。

表4 QAMS待测成分定位

2.2.4样品含量测定 取川射干配方颗粒5批，按2.1.3项下方法平行配制3份供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样分析，分别采用ESM、QAMS计算各待测成分的含量，结果见表5。结果表明，2种方法测得的川射干配方颗粒中有效成分的含量无明显差异。

表5 各成分含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 QAMS中内参物的选定

野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B等对照品价格昂贵，射干苷为常用的对照品，廉价易得、性质稳定，实验发现射干苷对照品即使溶液长时间放置，其峰面积亦不会发生较大的变化。因此，本研究以射干苷为内参物对川射干配方颗粒中其他4种异黄酮类成分的含量进行测定。

3.2 供试品溶液制备方法的筛选

本研究利用单因素实验，分别对提取方式、提取溶剂、溶剂用量、提取时间进行考察，结果表明采用体积分数为70%的乙醇作为提取溶剂、溶剂用量50 mL、超声提取30 min制备的供试品溶液检测出的色谱峰的数量相对较多，各峰高比例适中，分离度较好，基线平稳，最终确定2.1.3项下的供试品制备方法。

3.3 流动相的筛选

本研究对流动相进行了筛选，分别采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2 mL·L-1磷酸水溶液、乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液等作为流动相，发现乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液按2.1.1项下比例梯度洗脱，各目标峰的理论板数、分离度、对称性均较好。

3.4 检测波长的选择

通过在200～400 nm下对射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B进行光谱扫描，发现各成分的最大吸收波长分别为264.4、264.6、264.5、266.1、265.5 nm，通过波长耐用性考察，发现波长为(265±2)nm时，各目标化合物的峰形、分离度、对称因子、理论板数及含量均无明显差异，最终将265 nm作为该方法的检测波长。

本研究采用ESM及QAMS对川射干配方颗粒中5种异黄酮类成分的含量进行了测定，结果表明，2种方法测定结果的相对偏差均小于1.0%，可在缺少野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B对照品的情况下通过各成分的fk/s和tk/s确定各成分的含量，从而实现对川射干配方颗粒5种异黄酮类成分含量的测定。本研究建立的QAMS可用于川射干配方颗粒的质量控制。