全自动生化仪检测小鼠血脂方法研究*

李丹丹 陈 勋 梅 俊 周庆兵 徐凤芹

(1.中国中医科学院西苑医院老年病研究所，北京 100091)(2. 中国中医科学院西苑医院检验科,北京 100091)

血脂测定可及时反应体内脂类代谢情况，定期检查血脂是血脂异常和动脉粥样硬化性心血管病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)防治的重要措施[1]，早期监测血脂水平变化是有效实施ASCVD防治措施的重要基础[2]。作为人类疾病替身的动物模型，规范其血脂测定方法同样十分重要。高脂饲料喂养Apo E-/-小鼠构建动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)模型是抗AS研究重要的模型之一[3-5]，准确反映小鼠血脂水平变化至关重要，但是文献报道的AS模型小鼠的血脂水平差异较大[6-10]，不仅受个体差异及造模方法的影响，还受到检测方法等因素的影响。

然而，前期实验发现，由于高脂饲料喂养的Apo E-/-小鼠血脂水平较高，在使用全自动生化仪检测血脂时存在实验结果超出检测系统线性范围的问题，导致检测结果不准确，从而影响实验结果的评估。因此本研究拟在全自动生化仪上通过样本稀释法优化AS模型小鼠血脂的检测条件，为抗AS基础研究提供可靠的技术方法和实验数据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物:12只6周龄SPF级雄性C57BL/6J背景的Apo E-/-小鼠，体质量(18±2)g，实验动物生产许可证：SCXK(京)2016-0002。生活环境为屏障环境，温度(22±2)℃，相对湿度(55±5)%。饲料购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，配方为：0.15%胆固醇，21%脂肪以及78.85%基础维持饲料。

1.1.2实验试剂和仪器:总胆固醇测定试剂盒(TC，货号为OSR6116)、高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(HDL-C，货号为OSR6187)、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(LDL-C，货号为OSR6183)和甘油三酯测定试剂盒(TG，货号为OSR60118)，购自贝克曼库尔特国际贸易(上海)有限公司。质控物购自英国朗道实验有限公司，货号为LE2661，批号为2664CH。全自动生化分析仪(AU480)购自Beckman Coulter。

1.2 实验方法

1.2.1模型构建:Apo E-/-小鼠普通维持饲料适应性喂养1周，高脂饲料喂养6周，自由饮水。6周后，夜间禁食后，次日异弗烷吸入麻醉，待呼吸频率降低至1次/s时，眼眶静脉丛采血300 μL，室温静置1 h后，4 ℃、3 000 rpm离心10 min，快速分离血清，立即-80 ℃冻存备用。

1.2.2样本血清制备:血清解冻后，制备1∶4、1∶6、1∶8和1∶10稀释血清作为上机检测血清，准确吸取血清10 μL，分别加入30、50、70及90 μL生理盐水，充分混匀后，备用。

1.2.3上机检测:经质控物检测合格后，各样本分别在全自动生化仪上检测。采用酶循环法检测血清TC和TG，直接法检测血清低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)，实验步骤参照厂家说明书。

1.2.4重复性实验:根据实验结果选择1∶6、1∶8和1∶10稀释血清进行重复性实验，反复测量2次考察该方法的重复性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 质控物结果

结果显示，质控物的TC、LDL-C、HDL-C及TG均在范围内，提示所采用的血脂测定试剂稳定和仪器工作正常，可进行样本检测，获取的数据可靠。结果如表1。

表1 血脂四项质控、检测范围以及质控物检测结果(mmol/L)

2.2 小鼠血清脂质含量测定结果

实验结果如表2所示，未稀释的小鼠血清总胆固醇含量均值及最小值均超过该试剂盒检测范围的上限，提示该实验模型小鼠的血清样本在该检测系统下数据可能存在误差。血清LDL-C含量的均值和最小值接近检测范围的上限，而最大值超过检测范围上限，同样存在相同的问题。以上结果提示小鼠血清中胆固醇含量过高，需要进行稀释后检测方可获得准确数据。

表2 小鼠血脂4项结果(mmol/L)

2.3 小鼠稀释血清TC和LDL-C含量测定结果

不同稀释倍数血清胆固醇含量结果如表3所示，其中小鼠血清TC和LDL-C含量的均值、中位数、最小值及最大值在4倍和6倍稀释条件下仍高于检测范围50%含量，而8倍和10倍稀释血清LDL-C检测结果处于检测系统线性范围之内，且TC在该稀释条件下检测结果同样满足范围要求。综合以上两个指标的结果，提示可将8倍和10倍稀释倍数作为该实验的血清稀释因子。

表3 小鼠不同稀释倍数血清TC结果(mmol/L)

2.4 重复性实验结果

表4 不同稀释倍数血清TC和LDL-C重测数据结果(mmol/L)

表5 不同稀释倍数批内血清TC和LDL-C重复测量变异率结果(CV%)

3 讨论

AS是一种以脂质斑块在动脉内膜下聚积为特征的全身性炎症性疾病，血脂异常是ASCVD发病机制之一[11]。定期检查血脂是血脂异常和ASCVD防治的重要措施，早期检出并监测血脂水平变化是有效实施ASCVD防治措施的重要基础[1]。临床上血脂检测的基本项目为TC、LDL-C、TG和HDL-C，同时也是抗AS基础研究领域重要的观测指标[11]。

TC是指血液中各脂蛋白所含胆固醇之和，是AS预防、危险评估及疗效观察的参考指标，其测定方法主要有化学法、色谱法及酶法。本研究采用的董军等[12]方法，即酶法，其优点是简便且易自动化，也是常规测定普方法。血清LDL-C与TC平行，是致AS的基本因素，不仅构成了斑块脂质核心，还是该慢性炎症性疾病的始动和维持因素，相对TC能更好的反应AS的发生进展。其主要测定方法[13-14]有超速离心法、色谱法、电泳法、沉淀法、Fried wald公式计算法等，本研究采用的是直接法。HDL中胆固醇含量稳定，能很好的反映HDL含量，大量流行病学资料显示血清HDL-C水平与ASCVD的发病危险成负相关，可以抑制血管壁细胞结合摄取LDL-C，阻止胆固醇在动脉壁的沉积。其测定方法[15]包括化学沉淀法、电泳法、直接测定法等，本研究采用的是直接法。TG是血液中各脂蛋白所含三酰甘油的总和，其升高很可能是通过影响LDL和HDL结构而有致AS作用，目前几乎所有的实验室普遍采用酶法作为其常规测定方法[16-18]。

检测血脂作为临床检验的重要方法，对于小鼠血脂检测同样适用[6-7,19-20]，尤其是在小鼠血清量较少不易获得的情况下，全自动生化仪检测法尤为适用。前期实验发现，全自动生化仪检测高脂饲料喂养的小鼠血脂时，血清TC和LDL-C含量高于检测范围上限，其反应曲线亦表明反应未完全进行，提示不能用血清直接测定血脂。同样有研究[7,19]发现了这个问题，而选择了稀释血清上机检测的方法。因此，本实验首先考察了全自动生化仪检测小鼠血清脂质含量的方法，结果显示未稀释的小鼠血清TC含量均值、最小值均超过该试剂盒检测范围的上限，提示该实验模型小鼠血清在该方法下与该试剂可能反应不完全，数据可能存在误差。同样血清LDL-C含量的均值和最小值接近检测范围的上限，而最大值超过检测范围上限，存在相同的问题。以上结果提示小鼠血清中胆固醇含量过高，需要稀释后进行检测，方可获得准确数据。

参考祝江等[7]和黄翰文等[19]研究，本实验通过生理盐水稀释血清到不同稀释倍数后，分别测定不同稀释倍数血清脂质含量，结果提示可将8倍和10倍稀释倍数作为该实验的血清稀释因子。综合同一稀释条件下重复测量的变异率结果，提示8倍稀释可能是检测血清脂质含量的最佳稀释条件。

本研究结果表明全自动生化仪适用于高脂饲料喂养构建的小鼠AS模型的血脂测量，且推荐8倍稀释血清进行上机检测，初步确立了本研究开展时AS小鼠血脂测定的参考方法，有待进一步应用。