基于TNF-α/NF-κB信号通路探讨银莱汤治疗肺炎的作用机制

胡莉 白辰 龙超君 卓丽清 朱敬儒 刘邵阳 于河 谷晓红 刘铁钢

银莱汤以肺与胃肠同治法组方，系首都名中医谷晓红教授治疗小儿肺炎经验方，临床效果显著[1]。“温邪上受，首先犯肺”，小儿处于肺炎肺热证时，易传变至阳明。根据中医“既病防变”的治未病思想，在小儿肺炎肺热证阶段时，以肺与胃肠同治立法组方的银莱汤，除可清肺脏之邪热，也可调畅胃肠气机，清泄胃肠积热，并阻断肺经邪热向胃肠的传变。前期研究[2-5]发现，银莱汤具有明确的抗炎作用，但其作用机制尚未明确。本研究以雾化吸入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制备幼年大鼠肺炎模型为基础，探讨银莱汤对本模型肺、肠组织的干预机制。

1 材料和方法

1.1 动物

SPF级雄性SD幼年大鼠40只，体质量(100±10)g，购自北京维通利华动物技术有限公司，许可证号：110011211102012854。饲养条件：室温(25±2)℃，湿度(50±10)%，每天换气，保持12小时/12小时光暗照明，食水不限。研究方案获动物伦理委员会批准(批准文号：BUCM-4-2021030305-1046)。

1.2 试剂

银莱汤药物颗粒，由金银花30 g、莱菔子10 g、连翘15 g、黄芩10 g、鱼腥草20 g、全瓜蒌15 g、前胡10 g组成，共110 g，购自北京康仁堂药业有限公司；醋酸泼尼松片(规格5mg/片)，购自浙江仙琚制药股份有限公司；LPS(批号：L2880)，购自Sigma公司；通用型组织固定液(批号：G1101)，购自武汉赛维尔生物科技有限公司；大鼠肿瘤坏死因子-α(transforming necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA试剂盒(批号：E-EL-R2856c、E-EL-R0015c、E-EL-R0012c)，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；兔多抗肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor-1，TNFR1,50KD)、兔多抗TNFR1相关死亡结构域蛋白(TNFR1-associated death domain protein，TRADD,35KD)、兔单抗肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor associated factor2，TRAF2,53KD)、鼠单抗受体相互作用蛋白1(receptor interacting protein1，RIP1,76kd)、兔单抗IκB 激酶 β(ikappaB kinaseβ，IKKβ,87KD)(批号：Ab19139、Ab223040、Ab126758、Ab72139、Ab178870)，购自Abcam公司；兔多抗细胞核因子-κBp65(nuclear factor-κBp65，NF-κBp65,65KD)(批号：10745-1-AP)，购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 仪器

微量移液器(Eppendorf)；电泳仪电源、垂直电泳槽、电转仪(型号：DYY-7C、DYCZ-24DN、DYCZ-40，北京六一仪器厂)；磁力搅拌器(型号：T8-1，江苏省金坛市中大仪器厂)；电子天平(型号：CPA，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；离心机(型号：HI650，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；酶标仪(型号：mμlISKANMK3，Thermo)。

1.4 分组、造模及给药方法

将40只SPF级SD大鼠随机分为正常组(normal control group，N)、肺炎组(pneumonia group，P)、银莱汤治疗组(pneumonia treatment group，PT)和醋酸泼尼松组(prednisone acetate，PRE)，每组10只。肺炎组、银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组以LPS(0.5 mg/mL)雾化造模，持续3天，2次/天，30分钟/次，正常组以纯水雾化吸入。雾化造模[6]后，银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组分别以银莱汤和醋酸泼尼松溶液灌胃(1 mL/100 g)，正常组和肺炎组以等量纯水灌胃。肺炎模型成模标准：取大鼠肺组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片后，以HE染色法检测肺病理，镜下观察到炎性改变[6]。

1.5 肺、结肠组织病理切片制作

经过3天的雾化、灌胃造模后；第4天上午，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)麻醉。冰上取肺、结肠组织，组织固定液固定，室温摇床放置24小时；蒸馏水清洗后进行梯度乙醇脱水，制作组织蜡块；冰上预冷切片(4 μm)，60℃烤片1小时。使用前将组织切片常规脱蜡复水，HE染色细胞核和细胞质，使用中性树胶封片，显微镜下观察肺、结肠组织病理变化。

1.6 肺、结肠组织炎症因子检测

每组取6只大鼠检测炎症因子。先制备组织样品上清液：准确称取组织重量，按重量(g)9倍的体积(mL)比例加入生理盐水匀浆，3500 r/分钟离心10分钟，取上清作为待测样品检测。严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，于酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(optical density，OD值)，计算肺、结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.7 肺、肠组织目标蛋白检测

分别取20 mg大鼠肺、结肠组织，加入RIPA裂解液裂解，于自动匀浆机中匀浆，匀浆完成后置于冰上30分钟充分裂解。BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2小时；分别加入TNFR1(1∶1000)、TRADD(1∶2000)、TRAF2(1∶1000)、RIP1(1∶500)、IKKβ(1∶1000)、NF-κBp65(1∶1000)一抗，4℃孵育过夜；TBST充分漂洗5次，每次5分钟；滴加HRP标记二抗(1∶50000)，室温孵育2小时，TBST充分漂洗5次，每次5分钟。将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1∶1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，置凝胶成像系统显影。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠肺、结肠组织病理变化

2.1.1 大鼠肺组织病理变化 HE染色显示，正常组肺组织肺泡结构完整、肺泡壁薄，未见炎性细胞浸润，细支气管结构完整清晰。肺炎组大鼠肺组织出现损伤，肺泡壁增厚，出现大面积炎症浸润，部分肺泡腔结构消失。银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织损伤较肺炎组减轻，肺泡结构完整性较好，炎性浸润减轻(见图1)。

注：A 正常组；B 肺炎组；C银莱汤治疗组；D醋酸泼尼松组。

2.1.2 大鼠结肠组织病理变化 HE染色结果显示，正常组大鼠结肠组织结构完整，隐窝较深，杯状细胞排列整齐，未见炎性细胞浸润，无溃疡。肺炎组大鼠结肠组织大部分呈现黏膜完整性破坏，结肠隐窝和杯状细胞明显减少，炎性细胞浸润增多。银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组大鼠结肠组织均有明显改善，隐窝变浅，杯状细胞增多，炎性细胞浸润减少(见图2)。

2.2 大鼠肺组织、结肠组织炎症因子表达水平

2.2.1 大鼠肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平 与正常组比较，肺炎组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显升高(P<0.01)，银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达也明显升高(P<0.01)。与肺炎组比较，银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显降低(P<0.01)。见表1。

注：A 正常组；B 肺炎组；C银莱汤治疗组；D醋酸泼尼松组。

表1 各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平比较

2.2.2 大鼠结肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平 与正常组比较，肺炎组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显升高(P<0.01)，银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达也明显升高(P<0.01)。与肺炎组比较，银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显降低(P<0.01。见表2。

表2 各组大鼠结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平比较

2.3 大鼠肺、结肠组织蛋白表达水平

2.3.1 大鼠肺组织中TNF-α/NF-κB信号通路上TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达 与正常组比较，肺炎组大鼠肺组织TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达明显升高(P<0.01)；银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织TNFR1、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达也明显升高(P<0.05、P<0.01)，银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织TRADD蛋白表达呈现升高趋势，但无统计学意义(P>0.05)。与肺炎组比较，银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织中TNFR1、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达明显降低(P<0.05、P<0.01)，TRADD蛋白表达呈现降低趋势，但没有统计学差异(P>0.05)。见图3、表3。

表3 各组大鼠肺组织中TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达水平比较

注：A 正常组；B 肺炎组；C银莱汤治疗组；D醋酸泼尼松组。

2.3.2 大鼠结肠组织中TNF-α/NF-κB信号通路上TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达 与正常组相比，肺炎组大鼠结肠组织TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达明显升高(P<0.01)；银莱汤治疗组大鼠结肠组织TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达明显升高(P<0.05、P<0.01)；醋酸泼尼松组大鼠结肠组织TNFR1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达明显升高(P<0.05、P<0.01)，TRADD、TRAF2、RIP1蛋白表达与正常组无统计学差异(P>0.05)。与肺炎组比较，银莱汤治疗组大鼠结肠组织中TNFR1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达明显降低(P<0.05、P<0.01)，TRADD、TRAF2、RIP1蛋白表达呈现降低趋势但无统计学差异(P>0.05)；醋酸泼尼松组大鼠结肠组织TNFR1、TRADD、TRAF2、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达明显降低(P<0.05、P<0.01)，RIP1蛋白表达呈现降低趋势但无统计学差异(P>0.05)。见表4、图4。

表4 各组大鼠结肠组织中TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达水平比较

注：A 正常组；B 肺炎组；C银莱汤治疗组；D醋酸泼尼松组。

3 讨论

肺与胃肠同治是小儿外感发热的核心治法之一。宣透卫分邪气，可清解肺经郁热；运化中焦气机，消导胃肠积滞，可清泄阳明气分热邪，肺胃肠同治共奏解热良效[7]。银莱汤全方由金银花、莱菔子、连翘、黄芩、全瓜蒌、鱼腥草、前胡组成；金银花善清肺胃之热，莱菔子下气化积、导滞祛邪，二者共用为君药；连翘上可清宣肺热，下能通利小便；黄芩彰显清肺之功，鱼腥草清热宣肺化痰，全瓜蒌肺肠同治，前胡下气降痰；全方诸药入肺、胃、大肠经，共同发挥肺与胃肠同治的作用。

由于肺与肠具有相同的胚胎起源，他们除了在结构上具有相似性[8]，在生理和病理状态下还可以相互影响[9]。目前肺—肠轴的研究包括两方面[10]：一是共同黏膜免疫反应，肺与肠之间免疫信号的传递以淋巴液为载体，当外来抗原被淋巴集结捕获后[11]，促使幼稚的T淋巴和B淋巴细胞致敏，通过肠系膜淋巴结进入血液，引发各个效应点的黏膜免疫。二是肺部疾病特别是感染性疾病造成的菌群紊乱可以通过免疫调节影响消化道，如注射IL-25的小鼠在其肺部发现了激活的肠道内固有淋巴细胞ILC2s，肺炎模型小鼠的肺部同样检测了肠道内固有淋巴细胞ILC3s，这些反应都可帮助机体抵抗感染[12]；肺部的微生物可以以Toll样受体(toll-like receptor，TLR)非依赖的方式协同激活宿主p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)，以放大促炎反应[13]；肠道菌群的代谢产物会影响肺部的免疫反应，肠道菌群可以通过调节T细胞促进抗炎反应，产生促炎性细胞因子破坏黏膜屏障，也可以通过抑制核转录因子抑制剂α(inhibitor a of NF-κB，IκBα)下调炎症反应，诱导产生抗菌肽、分泌性免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)防御黏膜损伤[14]，故肺脏疾病治疗肺的同时需增强肠道防护功能来减轻肺部的免疫反应。

肺—肠轴作为连接呼吸道与胃肠道之间的双向通道，在疾病的发生发展上表现为“肺病及肠”和“肠病及肺”两个方面[6,15-16]，如肠黏膜有极其丰富的毛细血管，是对缺血缺氧最敏感的部位，这一代谢活跃的器官在慢阻肺患者日常活动中反复出现局部缺氧而影响其功能[17]；且在团队前期前瞻性研究的基础上，可以发现胃肠积热与呼吸道感染存在相关性[18]；实验研究证明，高热量饮食已被证明会加重肺炎的病情并延迟康复，尤其是在儿童中[19]。银莱汤可以通过调节宿主免疫炎症反应、血管生成和血管通透性、气道上皮细胞的屏障功能、激素释放和细胞生长、增殖和凋亡来减轻肺炎的症状和体征[6]。在共同黏膜免疫和肠道菌群对呼吸道和胃肠道的联系外，目前对肺与肠直接联系较少，且前期通过网络药理学分析，得到银莱汤相关通路中与炎症关系最为密切的是TNF信号通路和TLRs信号通路，两者又共同包含NF-κB信号通路，故基于TNF-α/NF-κB信号通路，探讨银莱汤治疗肺炎中对肺、肠组织的干预机制具有重要意义。

TNF-α是免疫的中间调节因子[20]。TNF-α是NF-κB的主要激活因子之一[21]，TNF-α能通过刺激NF-κB p65的磷酸化并帮助它转移到细胞核，同时它又能激活许多靶基因，其中包括TNF-α自身[22]，形成促炎反应的积极循环。TNF-α刺激的TNF-α受体1(tumor necrosis factor receptor-1，TNFR1)通过招募上游信号分子，如TNF受体相关因子2(TNF receptor associated factor 2，TRAF2)和IκB 激酶(IκB kinase β，IKK)，触发TNF-α/NF-κB的反应，形成TNFR1复合物[23]。在TNF-α未与TNFR1结合前，TNFR1在胞内区域和一种抑制蛋白(silencer of death domain，SODD)结合，防止TNFR1胞内区在无TNF-α的状态下发生自聚反应引起通路的激活[24]。只有当TNF-α三聚体结合到TNFR1的胞外区后，胞内区上的SODD随之被释放[24]，TRADD通过与TNFR1的死亡结构结合，形成TNFR1/TRADD复合体，随后招募一系列的受体相关蛋白到复合体上，包括TRAF2、RIP，形成TNFR1复合体引发下游的信号通路[25]。

NF-κB信号传导是一种关键的促炎症途径，NF-κB由RelA(p65)/p50异源二聚体组成[26]，p65是NF-κB通路激活的主要转录调节剂[27]，通过将p65DNA结合因子转移到细胞核发出信号[28]。在静息状态下，无活性的NF-κB被一种称为IκB的抑制性亚基保留在细胞质中[29]。含有IKKα、IKKβ的IKK和调节蛋白NF-κB必需修饰剂(NF-kappaB essential modulato，NEMO)对IκB的磷酸化是NF-κB激活对各种刺激的关键步骤[26,30]，被磷酸化后的IκBα和p65进入核内起始转录。

本研究结果显示，LPS激活幼年大鼠肺组织，使得大鼠肺组织和结肠组织TNF-α/NF-κB信号通路上TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达均增多，促进了IKKα和IKKβ的磷酸化，NF-κBp65表达随之增多，促进肺组织和肠组织中的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达增多；释放的促炎因子TNF-α又可反馈激活TNF-α/NF-κB信号通路，形成积极的促炎反应循环，加重肺组织和结肠组织的炎症损伤。给予银莱汤和醋酸泼尼松后，可减轻肺组织和结肠组织的炎性损伤和病理变化，并调控TNF-α/NF-κB信号通路上TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白水平的表达，降低肺组织和结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。本研究结果明确了银莱汤通过抑制IKKα、IKKβ磷酸化和p65核易位来抑制TNF-α诱导的NF-κB激活。本研究表明银莱汤通过抑制TNF-α诱导的NF-κB调节靶基因产物，改善肺组织、肠组织的炎性损伤和病理变化。