青蒿琥酯诱导肺腺癌细胞凋亡作用研究

尤杨 曲艺 刘亮

肺癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，发病率及病死率较高，对人们的生命健康构成严重威胁[1-3]。肺腺癌是肺癌常见的病理类型，占肺癌的主要组能部分。目前，肺腺癌常规的治疗方法包括手术、化学药物治疗及放射治疗。早发现、早诊断、早治疗可以显著提高肺腺癌患者的生活质量及生存期。部分患者就诊时已是中晚期，失去手术治疗的最佳时期，化学药物治疗将成为其主要的治疗方法之一。影响化疗疗效的主要因素包括药物的毒副作用及肿瘤细胞对化疗药物的耐药。因此，探寻高效低毒的抗肺腺癌药物具有重要意义。在肿瘤治疗史上，中草药对于肿瘤的治疗具有重要的意义，且具有独特的低毒不良反应的特点[4-6]，青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，来源于植物黄花蒿。青蒿素具有特异的抗疟作用，被广泛应用于临床治疗疟疾。青蒿琥酯作为青蒿素的衍生物，具有特异的抗疟作用，且对于重型及耐药型疟疾治疗效果甚佳[7-9]。研究发现，青蒿琥酯除具有特异的抗疟作用外，还具有较多的其他生物活性，如抗肿瘤[10,11]，调节免疫力[12]及抗动脉粥样硬化[13]等生物活性。目前有较多文献报道了青蒿琥酯的抗肿瘤作用，其对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用，本研究在以往的实验中发现，青蒿琥酯对消化道肿瘤(胃癌及食管癌等)细胞具有生长抑制作用，其作用机制与诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞有关[14,15]，但青蒿琥酯抑制肺腺癌细胞生长作用的研究笔者所见鲜有报道。本研究探讨青蒿琥酯抗肺腺癌作用及其相关的作用机制，为临床肺腺癌治疗提供高效低毒的药物。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒，美国Beckman Coulter公司；青蒿琥酯(60 mg，批号:LA150444)，中国桂林南药股份有限公司；活性氧检测试剂盒，中国碧云天生物技术公司；流式细胞仪(FC500型)，美国Beckman Coulter公司。

1.2 MTT 实验方法检测青蒿琥酯对肺腺癌A549细胞生长抑制率 调整肺腺癌A549细胞悬液浓度至5×104个/ml，按照每孔0.2 mlA549细胞悬液量接种于96孔细胞培养板中，代细胞贴壁后，分别加入不同浓度的Art (0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400、800 μg/ml)，每个药物剂量重复3个复孔，待药物作用24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液温箱内继续培养4 h后，而后弃去培养液，每孔加入180 μl DMSO，振荡10 min。选择490 nm波长，在酶标仪上测定光密度值A490。生长抑制率 (%)=(1-用药组A490/对照组A490)×100%。

1.3 青蒿琥酯干预肺腺癌A549细胞实验 将处于对数生长期的肺腺癌A549细胞(浓度为1.25×106/ml)4 ml 接种于培养瓶中。待细胞贴壁后，加入不同浓度的Art，使终浓度分别达到25、50、100 μg/ml，分别命名为25、50、100 μg/ml Art组。实验重复3次。对照组使用0.9%氯化钠溶液代替Art。作用时间为24 h。而后收集细胞，PBS洗涤细胞2次。将细胞浓度调整为1×106/ml。

1.4 Art干预A549细胞后FCM检测细胞凋亡率 将1.3实验步骤中制备的单细胞悬液1 ml(含1×106个细胞)，使用PBS液洗涤1次，去上清，加入100 μl 1×binding buffer，而后加入5 μl Annexin V-FITC，避光放置15 min，加入1×binding buffer 390 μl及PI 5 μl， 避光放置15 min，使用流式细胞仪(FC500型，Beckman Coulter)检测。

1.5 FCM检测Art干预A549细胞后细胞内活性氧 将1.3实验步骤中制备的单细胞悬液1 ml(含1×106个细胞)，使用PBS液洗涤1次，去除上清液，加入荧光探针10 μmol/L DCFH-DA，在37℃下避光染色20 min，PBS洗涤细胞1次后，1 ml PBS液悬浮细胞，FCM检测。

1.6 FCM检测Art干预A549细胞后Caspase-3蛋白 将1.3实验步骤中制备的单细胞悬液1 ml(含1×106个细胞)使用PBS液洗涤1次，将上清液弃去，加入100 μl PBS液，加入100 μl Caspase-3抗体，避光放置30 分钟，而后加入100 μl二抗，避光放置30 min后加入10 ml PBS液,1 000转5 min离心，去上清，加入1 ml PBS液，FCM检测细胞中Caspase-3蛋白表达。

2 结果

2.1 青蒿琥酯抑制肺腺癌A549细胞生长作用 不同浓度青蒿琥酯(浓度范围0.1～800 μg/ml)作用肺腺癌A549 细胞24 h后，出现不同程度A549细胞生长抑制，青蒿琥酯对A549细胞生长抑制作用具有青蒿琥酯浓度依赖性(P<0.01)，800 μg/ml Art组与0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400 μg/ml Art组相比，A549细胞生长抑制率显著增高(P<0.01)。青蒿琥酯作用A549细胞24 h的IC50值为(52.87±2.36)μg/ml。见表1。

表1 青蒿琥酯抑制肺癌细胞生长

2.2 青蒿琥酯诱导肺腺癌A549细胞凋亡作用 不同浓度的青蒿琥酯(浓度范围25～100 μg/ml)作用肺腺癌A549细胞24 h后，A549细胞呈现不同程度细胞凋亡，且青蒿琥酯诱导A549细胞凋亡作用具有青蒿琥酯浓度依赖性。(25、50、100 μg/ml)青蒿琥酯组与对照组相比，细胞凋亡率显著增高(P<0.01)。100 μg/ml青蒿琥酯组A549细胞凋亡率显著高于25及50 μg/ml青蒿琥酯组A549细胞凋亡率(P<0.01)。见表2。

表2 青蒿琥酯作用后A549细胞凋亡率

2.3 青蒿琥酯调控肺腺癌A549细胞内活性氧表达水平作用 25、50、100 μg/ml青蒿琥酯作用肺腺癌A549细胞24 h，与对照组相比，细胞活性氧水平显著增高(P<0.05)。100 μg/ml青蒿琥酯组与25及50 μg/ml青蒿琥酯组相比，A549细胞活性氧水平显著增高(P<0.01)，青蒿琥酯可以显著上调A549细胞内活性氧的表达水平，且具有青蒿琥酯剂量依赖性。见表3。

表3 青蒿琥酯上调肺腺癌A549细胞内活性氧表达水平

2.4 青蒿琥酯调控肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达 25、50、100 μg/ml青蒿琥酯组与对照组相比，A549细胞中Caspase-3蛋白表达水平显著增高(P<0.05)，且具有青蒿琥酯浓度依赖性。100 μg/ml青蒿琥酯组A549细胞中Caspase-3蛋白表达显著高于25及50 μg/ml青蒿琥酯组细胞中的表达(P<0.05)，青蒿琥酯可以显著上调A549细胞中Caspase-3蛋白表达水平，且具有青蒿琥酯剂量依赖性。见表4。

表4 青蒿琥酯调控肺腺癌A549细胞中Caspase-3蛋白表达

3 讨论

肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤，发病及死亡率均居恶性肿瘤的首位[16-18]。肺腺癌是肺癌常见的病理类型。目前，肺腺癌的主要治疗包括，手术、化学药物治疗及放射治疗。早发现、早诊断、早治疗可以显著提高肺腺癌患者的生活质量及生存期。部分患者就诊时已是中晚期，失去手术治疗的最佳时期，化学药物治疗将成为其主要的治疗方法之一。化疗期间，药物的毒副作用及肿瘤细胞对药物的耐药严重影响化疗疗效，因此，急需探寻低毒、高效的抗肺腺癌药物。在肿瘤治疗史中，中草药治疗肿瘤占据重要的地位，且中草药具有价廉、低毒等优点。因此，从中草药中寻找抗肿瘤药物，具有重要意义。

青蒿琥酯是青蒿素的衍生物[19-21]，青蒿素来源于植物黄花蒿。青蒿琥酯作为青蒿素的衍生物，具有特异的抗疟作用，且对于重型及耐药型疟疾治疗效果甚佳[22-25]。进一步的研究显示，青蒿琥酯还具有其他生物活性，例如抗肿瘤[26]、抗炎[27]、抗病毒[28]、抗动脉粥样硬化[13]等生物活性。文献显示，青蒿琥酯可以通过调控肿瘤细胞的凋亡及细胞周期，从而起到抗肿瘤作用[29]，本研究显示，青蒿琥酯可以通过抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制食管癌及胃癌细胞生长，起到抗食管癌及胃癌作用[14,15]。Dong等[30]研究显示，青蒿琥酯可以抑制裸鼠接种MCF-7细胞皮下移植瘤生长，其作用机制与诱导细胞G0/G1期周期阻滞及细胞凋亡有关。Holien等[31]研究显示，青蒿琥酯在安全剂量下可以诱导淋巴瘤及骨髓瘤细胞生长停滞及细胞凋亡，没有严重的毒副作用。Pang等[32]研究显示，青蒿琥酯可以引起肝癌细胞凋亡从而起到抗肝癌的作用，其诱导肝癌细胞凋亡作用机制与调控活性氧诱导Bax依赖的内源性细胞凋亡有关。Li等[33]研究显示，青蒿琥酯通过抑制Wnt/beta-catenin 通路的活性，从而抑制结直肠癌生长。本研究青蒿琥酯抑制肺腺癌A549细胞生长抑制作用机制，为将青蒿琥酯用于抗肺腺癌药物提供实验基础。

细胞增殖与细胞凋亡的稳态对于维持机体正常组织生长具有重要意义，一但稳态失衡就会引起疾病发生，包括肿瘤的发生。Kaczanowski等[34]综述了细胞凋亡与肿瘤的发生密切相关，细胞凋亡紊乱引起肿瘤。Tenorio等[35]研究显示，细胞凋亡调控蛋白和细胞周期蛋白在牙源性上皮性病变中表达不同，其表达可能与成釉细胞瘤(AMB)、牙源性角化囊肿(OKC)和牙源性腺瘤样肿瘤(AOT)的生物学行为有关。Evan等[36]综述了细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡与癌症的关系，显示细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的紊乱参与了癌症的发生及发展。以上研究显示，细胞凋亡与肿瘤的发生密切相关。细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，因此，目前在寻找新的抗肿瘤药物中，将药物是否能够诱导肿瘤细胞凋亡作为药物是否具有抗肿瘤作用的观测点之一。Wang等[37]研究显示，敲低胰腺癌细胞中KDM1B基因表达，可以抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡，从而抑制胰腺癌的进展。Lin等[38]研究显示，Bakuchiol可以诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞从而抑制胃癌细胞增殖，起到抗胃癌的作用。Jalali等[39]研究显示，Kefir可以抑制人急性红白血病细胞增殖及诱导细胞凋亡，从而有可能是治疗人急性红白血病的一种有效的方法。Ramdani等[40]研究显示，Spiro-bisheterocycles可以抑制乳腺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡，从而可以将Spiro-bisheterocycles开发为抗乳腺癌药物。以上的研究均显示了，诱导细胞凋亡可以起到抗肿瘤的作用。本研究利用MTT实验检测到，Art抑制A549细胞生长，且具有Art浓度依赖性。计算半数抑制浓度(IC50值)为52.87 μg/ml，因此后续实验中选择了25、50、100 μg/ml青蒿琥酯进行细胞干预实验。AnnexinV/PI双染细胞利用流式细胞术检测细胞凋亡已是细胞凋亡检测的金标准，文中检测到青蒿琥酯作用A549细胞24 h后，细胞出现不同程度的细胞凋亡，青蒿琥酯浓度越大细胞凋亡率越高，此实验结果与以往研究的青蒿琥酯诱导食管癌及胃癌细胞凋亡作用结果[14,15]一致。

活性氧(reactive oxygen species)是体内一类氧的单电子还原产物，活性氧的平衡维持机体细胞正常功能，一旦机体中活性氧增多就会导致细胞功能障碍引起疾病。过量的活性氧的主要靶细胞器为线粒体，可以诱导线粒体双层膜通透孔开放，释放钙离子、细胞色素C、凋亡诱导因子AIF等引起胱冬蛋白酶Caspase-3等激活，使线粒体外膜破裂，导致细胞凋亡。Prasad 等[41]综述了活性氧在癌症发展的各个阶段中的作用，活性氧的紊乱参与肿瘤的发生及发展，且显示从大自然中提取的营养制剂可以通过调控活性氧从而起到抗癌作用。Moloney等[42]研究显示，活性氧信号通路与癌症发生及发展密切相关。本研究中检测到青蒿琥酯作用后，A549细胞出现活性氧增多，而且具有青蒿琥酯剂量依赖性。提示，青蒿琥酯可以提高A549细胞中活性氧表达量，引起细胞凋亡。

Caspase 3是一种蛋白酶，与细胞凋亡密切相关。Caspase 3活化可以引起核酸内切酶的活化，引起细胞凋亡。Huang等[43]研究显示，Solanum nigrum polysaccharides可以抑制肝癌细胞H22荷瘤小鼠的瘤体生长，其抑瘤作用机制与上调细胞中caspase-3表达及下调bcl-2表达有关。Yao等[44]研究显示，Boschniakia Rossica Polysaccharide通过调控喉癌细胞Bcl-2、Caspase-3及P53表达，引起喉癌细胞凋亡，从而起到抑制喉癌细胞生长作用。Pengju等[45]研究显示，NKX3.1通过增加Caspase-3的表达及其活性增强TNF-αlpha/CHX诱导前列腺癌细胞凋亡，从而起到抗前列腺癌作用。以上研究显示，增加Caspase-3的表达及其活性可以导致细胞凋亡，从而起到抗肿瘤作用。Art干预后，A549细胞中Caspase-3蛋白表达量增高，且具有青蒿琥酯剂量依赖性。Caspase-3表达量增高可以引起不可逆性细胞凋亡。

综上所述，青蒿琥酯对肺腺癌A549细胞具有生长抑制作用，其作用机制为青蒿琥酯上调A549细胞内活性氧及Caspase-3蛋白表达，导致A549细胞产生凋亡。我国是具有药用效果青蒿素的主要产地，青蒿琥酯来源于青蒿素是其衍生物之一，能保证青蒿琥酯的高产量。