高温闷棚对设施蔬菜根结线虫的防治效果及土壤微生物群落结构的影响

何 伟，罗文芳，于镇华,许建军，孙晓军

(1.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；2. 中国科学院东北地理与农业生态研究所/黑土区农业生态重点实验室，哈尔滨 150081)

0 引 言

【研究意义】根结线虫是一种高度专化型的植物病原线虫，近年来，随着设施蔬菜种植面积的增加，根结线虫病已成为严重威胁新疆设施蔬菜生产的一种重要土传病害[1]。研究高温闷棚对蔬菜根结线虫和根际土壤微生物群落的影响。对研究适宜本地的绿色防控技术具有重要意义。【前人研究进展】目前，蔬菜生产上防治根结线虫方法有抗病品种[2]、嫁接栽培技术[3]、农业防治[4]、生物防治[5-6]和化学防治[7-8]，其中以化学防治为主。但化学药剂造成蔬菜品质下降、环境污染及人体健康的问题日益突出。高温闷棚作为一种有效的防治病害的措施被广泛应用，如高温闷棚防治黄瓜霜霉病[9]、白粉病[10]、西瓜枯萎病[11]、茄子黄萎病[12]、根结线虫病[13]及消除土壤连作障碍[14]等已有相关报道。高温闷棚不仅可以有效杀灭温室中的病原微生物，其对土壤微生物群落也会产生影响。李佳川[15]报道，灌水高温闷棚处理后，土壤微生物区系表现为细菌及放线菌含量升高，真菌含量降低。宋健等[16]报道日晒高温覆膜对韭菜根际土壤微生物多样性无显著影响。何志刚等[17]研究表明，高温闷棚是否淹水是影响土壤微生物群落划分的主要因素。【本研究切入点】长期以来，新疆设施蔬菜种植户在夏季高温时仅采用扣棚方式闷棚，但此方法地温达不到杀死根结线虫的温度。【拟解决的关键问题】研究新疆高温干旱区温室灌水+覆膜、灌水+覆膜+药剂及灌水未覆膜高温闷棚处理对土壤根结线虫及土壤微生物群落结构影响，为新疆区域高温闷棚防治根结线虫提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

10%噻唑膦颗粒剂(日本石原产业株式会社)、10.2%阿维·噻唑啉颗粒剂(江西众合化工有限公司)、5%阿维菌素乳油(江西众合化工有限公司)。自计式土壤温度记录仪，型号：L93-3(杭州路格科技有限公司)。

试验于2019年7～8月在吐鲁番市高昌区亚尔乡建设七队温室进行。试验温室结构为干打垒温室，长120 m，宽8 m。在上茬番茄拉秧后，及时清除病残体，铲除田间杂草，带出棚外深埋，保持棚架完好，棚膜完整，无破损。均匀撒施鸡粪在土壤表面，用量4 000 kg/667m2，深翻25～30 cm。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

试验设置在同一个温室中，6个处理，每处理140 m2，3次重复，小区长20 m，宽7 m。10%噻唑膦颗粒剂和10.2%阿维·噻唑膦颗粒剂各0.42 kg分别与细土混匀后均匀撒于土壤表面，5%阿维菌素乳油稀释3 000倍，均匀喷洒于土壤表面，采用旋耕机进行土壤深耕。每处理四周做坝，灌水，水面高出地面3～5 cm，盖好厚度为0.08 mm旧棚膜，四周用土压严实，扣棚进行闷棚处理24 d，闷棚结束后进行耕翻，晾晒15 d后直播生菜。

在高温闷棚后增施生物菌肥。在直播生菜第1次灌水时，将微生物菌剂宁盾一号A型随水冲施，用量为10 L/667m2，第2次灌水时，5L/667m2。表1

表1 处理方法Table 1 Test treatment method

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 土壤温度监测

采用自计式土壤温度计(温度记录间隔5 min)记录土壤温度变化情况，覆膜后将土壤温度计插入土壤，探头插入深度分别为10、20、30 cm土壤中，闷棚结束后，取回温度记录仪，将数据转入计算机，使用Excel分析数据。

1.2.2.2 土壤样品采集

闷棚前、后和生菜收获期，分别采用取土器取深度0～20 cm土壤，每处理随机取10个点，混匀后部分土壤用于检测根结线虫数量，部分土壤-20℃保存用于微生物检测。闷棚前处理1～6土壤样本编号为A1～A6，闷棚后处理1～6土壤样本编号为B1～B6，生菜采收期处理1～6土壤样本编号为C1～C6。

1.2.2.3 土壤理化性质

将采集的土壤样品进行处理，经自然风干、研磨过筛(1 mm)后，测定土壤的理化性质。速效氮采用碱解扩散法，速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法，速效钾采用1 mol/L NH4OAc浸提-火焰光度法，pH值采用pH计按土水比1∶2.5测定。

1.2.2.4 土壤根结线虫数量

采用浅盘分离法与漏斗分离法分离线虫，具体步骤如下：取一根橡皮管，一端用夹子夹住，另一端连接漏斗，放在漏斗架上，在100目的标准冲筛框上垫1张面巾纸，装入称好的100 g土样，铺平，往漏斗内加水，水漫过土壤约0.5 cm左右，静置24 h后，松开止水夹，将漏斗中水缓慢放入小烧杯内，最后在体视显微镜下统计根结线虫2龄幼虫的数量。

1.2.2.5 土壤微生物 DNA 提取及高通量测序

根据FastDNA®Spin Kit for Soil 试剂盒的操作步骤提取土壤微生物总 DNA，PCR 所用的细菌引物为V3-V4 通用引物，338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′[18]；真菌引物为通用引物，ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′[19]，微生物扩增子高通量测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤温度监测

研究表明，灌水+覆膜处理10、20和30 cm深土壤最高温度分别为60.1、53.5和46.6℃，持续时间为50 min；灌水未覆膜处理分别为55、46.8和43.2℃，持续时间为45 min；空白对照分别为48、48.3和41.3℃，持续时间为40 min。灌水+覆膜可以增加土壤温度，且高温持续时间长。图1

图1 不同土壤深度的温度变化Fig. 1 Temperature changes in different soil depths

2.2 不同时期各处理土壤根结线虫检测

研究表明，闷棚后灌水+覆膜+药剂和灌水+覆膜处理土壤根结线虫虫口减退率100%，灌水未覆膜虫口减退率为83.1%。生菜采收期，各处理均无根结线虫危害，灌水+覆膜+药剂和灌水+覆膜处理土壤根结线虫虫口减退率在99%以上，灌水未覆膜处理虫口减退率69.4%。表2

表2 不同处理对土壤根结线虫防治效果比较Table 2 Comparison of control effects of different treatments on soil root-knot nematodes

2.3 不同时期各处理土壤养分差异

研究表明，高温闷棚后较闷棚前，处理1～4土壤速效氮含量无显著差异性，处理5和6显著下降；处理1～5土壤速效磷含量显著增加，处理6无显著差异；处理1～6土壤速效钾含量显著降低；处理1和5土壤pH值显著下降，其他处理无显著差异。生菜采收期较高温闷棚后，处理1～4土壤速效氮含量无显著差异，处理5和6显著增加；处理1～6土壤速效磷含量显著下降；处理1～6土壤速效钾含量显著增加；处理1土壤pH值显著增加，其他处理无显著差异。图2

注：数值为平均值±标准误，不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05)。A为闷棚前；B为闷棚后；C为生菜采收期

2.4 样品间Beta 多样性

研究表明，细菌主成分 1(PC1)、主成分 2 (PC2)的样品差异性贡献率分别为 37.07%、14.99%，合计达到52.06%。真菌主成分 1(PC1)、主成分 2 (PC2)的样品差异性贡献率分别为 17.72%、15.03%，合计达到22.75%。高温闷棚前、后和生菜采收期3个时间点土壤样本距离均较远，3个时间点土壤中真菌、细菌组成成分均存在显著差异；闷棚前、后和生菜采收期中每个时期6个处理土壤样本距离较近，每个时期土壤中真菌、细菌组成成分相近。图3

2.5 对土壤微生物多样性的影响

研究表明，闷棚前、后和生菜采收期6个不同处理分别得到1 280 147、1 280 147和1 118 042条有效序列。Coverage测序深度指数均大于99.7%，表明测序深度已基本上覆盖到样品中所有的物种。高温闷棚后，灌水+覆膜+阿维菌素土壤中的真菌物种丰度和多样性均减少；空白对照土壤中真菌物种丰度下降，但真菌物种多样性增加；其他4个处理土壤真菌物种丰度和多样性均增加。生菜采收期真菌物种丰度增加，但真菌物种多样性下降。表3

闷棚前、后和下茬生菜采收期6个不同处理分别得到1 127 237、818 676和989 102条有效序列。Coverage测序深度指数均大于97.5%，表明测序深度已经覆盖到测试样品中大部分物种。结果表明，高温闷棚后，6个处理土壤样本中细菌物种丰度和多样性均较高温闷棚前下降，生菜采收期，细菌物种丰度和多样性均较高温闷棚后上升。表4

注:A是细菌；B是真菌。A01～A06是闷棚前处理1～6；B01～B06是闷棚后处理1～6；C01～C06是生菜采收期处理1～6。下同

2.6 门水平上真菌群落结构

研究表明，不同时期各处理土壤样本中真菌优势菌门有显著差别。高温闷棚后较闷棚前，6个处理土壤中被孢霉门丰度显著下降，处理1和6担子菌门丰度显著下降，其他处理担子菌门丰度显著增加。生菜采收期，处理6被孢霉门丰度较高温闷棚后无显著差异，其他各处理的被孢霉门丰度显著降低。图4

图4 门水平上真菌样本的群落组成Fig. 4 The community abundance analysis of fungal genes at the phylum level

2.7 门水平上细菌群落结构

研究表明，高温闷棚后，处理1和6土壤样本中变形菌门Proteobacteria丰度增加，异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus丰度无显著变化，其他处理变形菌门丰度下降，异常球菌-栖热菌门丰度增加。6个处理土壤样本中芽单胞菌门Gemmatimonadetes、酸杆菌门Acidobacteria、硝化螺旋菌门Nitrospirae和浮霉菌门Planctomycetes丰度显著降低，厚壁菌门Firmicutes丰度显著增加；处理1土壤样品中绿弯菌门Chloroflexi丰度下降，其他处理绿弯菌门丰度增加。

生菜采收期较高温闷棚后，处理1和6土壤样品中变形菌门丰度下降，其他处理丰度增加；处理1绿弯菌门丰度增加，其他处理绿弯菌门丰度下降；6个处理拟杆菌门丰度显著增加；处理6厚壁菌门丰度无显著变化，其他处理厚壁菌门丰度显著降低。图5

表3 真菌的多样性指数Table 3 The analysis of alpha diversity estimators of fungi

表4 细菌的多样性指数Table 4 The analysis of alpha diversity estimators of bacteria

图5 门水平上细菌样本的群落组成Fig.5 The community abundance analysis of bacteria genes at the phylum level

2.8 属水平上真菌群落结构

研究表明，高温闷棚后较闷棚前，处理1和6土壤样品中链格孢属Alternaria和枝孢属Cladosporium丰度变化小，被孢霉属Mortierella丰度增加，其他处理链格孢属和枝孢属丰度增加，被孢霉属丰度无显著变化。生菜采收期较高温闷棚后， 6个处理被孢霉属和曲霉属Aspergillus丰度均下降；处理2、3、4链格孢属丰度增加，处理5、6翅孢壳属Emericellopsis丰度增加。图6

图6 属水平上真菌样本的群落组成Fig.6 The community abundance analysis of fungal genes at the genus level

2.9 属水平上细菌群落结构

研究表明，高温闷棚后较闷棚前，6个处理uncultured_bacterium_f._Gemmatimonadaceae、芽单胞菌属Gemmatimonas、RB41和uncultured_bacterium_f_Rhodospirillaceae丰度下降，芽孢杆菌属Bacillus、uncultured_bacterium_f_Longimicrobiaceae和亚栖热菌属Meiothermus丰度增加；处理1和6鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas丰度增加，uncultured_bacterium_c_S0134_terrestrial_group丰度下降，其他4个处理鞘氨醇单胞菌属丰度下降，uncultured_bacterium_c_S0134_terrestrial_group丰度增加。生菜采收期较高温闷棚后，处理5uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae丰度下降，其他处理丰度增加；处理1和6鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas和亚栖热菌属Meiothermus丰度下降，其他处理丰度增加；处理6芽孢杆菌属Bacillus丰度增加，其他处理丰度下降；处理1芽单胞菌属Gemmatimonas丰度略有下降，其他处理丰度增加；6个处理uncultured_bacterium_f_Longimicrobiaceae丰度下降，黄杆菌属Flavobacterium丰度增加。图7

图7 属水平上细菌样本的群落组成Fig.7 The community abundance analysis of bacteria genes at the genus level

3 讨 论

3.1 不同处理高温闷棚对土壤根结线虫防治效果

研究表明，新疆吐鲁番温室采用仅扣棚的传统闷棚方法，土壤温度达不到对根结线虫致死温度，灌水+覆膜后再扣棚的高温闷棚方法，10 cm深土壤温度可达60℃以上且可持续50 min。15～30℃是根结线虫的适宜生长繁殖温度，40℃以上高温和5℃以下低温即可抑制2龄幼虫存活和卵囊中卵孵化，雌虫不能发育完全[20]。根结线虫主要分布在0～30 cm的表层土壤内，该虫在55℃的温度条件下，经8～10 min即可致死[21]。研究与前人研究结果一致，为改变新疆吐鲁番温室高温闷棚方式提供了科学依据。

3.2 高温闷棚对土壤微生物群落结构的影响

温度是影响土壤微生物群落结构主要因子之一。温度升高增加了土壤中真菌丰度，促进了土壤对菌类中一些酶的利用效率，影响了土壤微生物群落结构已报道[22]。有报道平均1.17℃的土壤升温使土壤微生物PLFAs总量增加34.58%，升温使细菌相对含量增加8.80%，而使真菌相对含量降低17.48%[23]。火灾引起的高温致使土壤细菌下降了16%，真菌和放线菌数量分别下降了3%和2%[24]。研究中前茬作物是辣椒，高温闷棚后土壤真菌物种丰度增加，细菌物种丰度和多样性均较高温闷棚前下降。不同区域土壤理化性质和种植作物的不同及土壤温度的高低、持续时间，可能是造成研究者研究结果差异的原因。

目前设施蔬菜根结线虫的防治仍然以化学防治为主，但其毒性高、易污染环境。秸秆生物反应堆技术[25]、石灰氮消毒[26]、生物菌肥[27]和高温闷棚[13]等绿色防控技术多有报道。但由于各单项技术在不同区域对根结线虫防治效果不同，因此，选择适宜区域的防治技术尤为重要。研究中高温闷棚后灌水+覆膜和灌水+覆膜+药剂处理的根结线虫虫口减退率均为100%。高温闷棚后需要及时补充有益微生物，筛选适宜新疆本地碱性土壤环境的微生物需要进一步研究。

4 结 论

新疆吐鲁番区域温室采用灌水+覆膜后再扣棚的闷棚方法，10 cm深土壤温度可达60℃以上且可持续50 min，根结线虫减退率为100%；闷棚后土壤真菌物种丰度增加，细菌物种丰度和多样性均下降，土壤中链格孢属、枝孢属真菌和uncultured_bacterium_c_S0134_terrestrial_group细菌含量增加，鞘氨醇单胞菌属含量降低。新疆吐鲁番及南疆温室蔬菜种植区域适宜推广灌水+覆膜的高温闷棚方式。