富氢水对干旱胁迫下大麦种子萌发的影响

宋瑞娇，冯彩军，齐军仓

(石河子大学农学院/新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室, 新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】大麦具有酿造、饲用、食用及药用价值[1]。在萌发阶段，缺水会对幼苗造成生长不可逆的伤害，并显著影响植物的产量与品质[2]。研究大麦萌发期对干旱胁迫的响应，对缓解干旱损伤具有重要意义。【前人研究进展】高等植物体内存在氢化酶[3]。在种子萌发期，氢气可能作为气体信号分子参与植物对逆境胁迫的响应。氢气可通过激活淀粉酶活性、加速还原糖和总可溶性糖形成的途径，减弱100 mmoL/L NaCl引起的萌发抑制[4]。富氢水(外源氢气供体)预处理后，水稻的硼中毒症状得到了改善，这种缓解作用是通过增强抗氧化酶活性，缓解氧化损伤实现的[5]。氢气还可在一定程度上调控赤霉素与脱落酸的动态平衡、维持根尖细胞及细胞核的完整性，并通过上述途径减轻重金属胁迫对禾谷类种子萌发的抑制[6, 7]。【本研究切入点】虽然已有研究表明，氢气参与作物萌发期的抗逆反应，但有关氢气对植物萌发阶段抗旱性的研究尚未见报道。研究富氢水对干旱胁迫下大麦种子萌发的影响。【拟解决的关键问题】以新啤6号大麦为试材，在聚乙二醇模拟的干旱条件下，研究富氢水预处理对大麦种子抗氧化和渗透调节系统的影响，分析富氢水对大麦抗旱性的调控机理，为增强大麦干旱适应能力提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试大麦品种为新啤6号，由石河子大学农学院提供。

1.2 方 法

1.2.1 胁迫浓度

选取大小均匀、籽粒饱满的大麦种子置于10%的次氯酸钠溶液中消毒10 min，蒸馏水洗净后将其避光浸于蒸馏水中24 h,期间每隔12 h更换1次新鲜的蒸馏水。之后将种子每50粒转移至铺设4层滤纸并含有40 mL不同浓度(0、10%、20%、21%、22%、23%、24%和25%)聚乙二醇-6000的发芽盒(10 cm×15 cm)中，于25℃、光暗比12 h/12 h、光照强度为400 μmol/(m2·s)条件下培养,每个处理重复3次。以胚根与种子等长、胚芽达到种子长1/2为发芽标准，7 d后统计发芽率，据此确定种子萌发的半致死干旱胁迫浓度。

1.2.2 富氢水制备

采用鼓泡法，用AK-H300氢气发生器(上海埃焜仪器设备有限公司)将纯度为99.994%的氢气以150 mL/min流速充入500 mL蒸馏水中1 h，制备出饱和氢气溶解度的富氢水。之后按比例迅速与蒸馏水混合至所需浓度。

1.2.3 发芽率、发芽势、发芽指数

选取大小均匀、籽粒饱满的大麦种子置于10%的次氯酸钠溶液中消毒10 min，蒸馏水洗净后将其避光浸于不同氢气溶解度(0、25%、50%、75%和100%)的富氢水中24 h,期间每隔12 h更换1次新鲜溶液。之后将种子每50粒转移至铺设4层滤纸，并含有40 mL半致死聚乙二醇-6000溶液的发芽盒(10 cm×15 cm)中，于25℃、光暗比12 h/12 h、光照强度为400 μmol/(m2·s)条件下培养，每个处理重复3次。以胚根达到种子长、胚芽达到种子长1/2记为发芽，每隔24 h记录发芽种子数，连续7 d，计算其发芽率、发芽指数和发芽势。

发芽率=7 d内能正常发芽的种子数/供试种子总数×100%；

发芽势=发芽高峰时期的发芽种子数/供试种子总数×100%；

发芽指数=∑(Gt/Dt)(Gt是第td的发芽数，Dt为相应的发芽时间)。

1.2.4 测定指标

萌发3 d后，直接选取长势均匀的种子测定相关指标，或用液氮速冻后置于-80℃冰箱以供后续实验分析。其中，使用磺基水杨酸法测定脯氨酸含量[8]；蒽酮比色法测定可溶性糖含量[8]；参考Bradford的方法测定可溶性蛋白含量[9]；采用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛含量[10]；氮蓝四唑还原法测定超氧化物歧化酶活性，以抑制光化还原50%为1个酶活性单位[10]；按Maehly和Chance的方法测定过氧化物酶和过氧化氢酶活性[11]。所有指标数据测定均为3次重复。

1.3 数据处理

采用SPSS19.0软件对数据进行统计分析，Duncan新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 富氢水对干旱胁迫下大麦种子发芽特性的影响

研究表明，大麦种子的发芽率随着聚乙二醇-6000浓度的增加而下降。当胁迫浓度达到10%时，种子的萌发受到显著抑制；聚乙二醇-6000浓度为20%时，大麦种子发芽率约为对照的一半；当胁迫浓度达到35%后，种子发芽率低于10%，萌发进程几乎被完全抑制。25%、50%及75%的富氢水为适宜浸种浓度，三者均可显著提高干旱胁迫下大麦种子的发芽率，相比于对照各高出了13.3、9.3与7.3个百分点，而100%的富氢水虽也表现出一定的促进效应，但作用并不显著。对萌发3 d后种子的发芽势作计量，25%与50%浓度的富氢水可将干旱胁迫下大麦种子的发芽势提升15.3与13.3个百分点，其余浓度差异均不显著。相较于对照，不同浓度富氢水处理下大麦种子的发芽指数都有所提高，但仅有25%、50%和75%的富氢水表现出显著的提升作用。以25%和50%富氢水处理效果最好。图1，表1

2.2 富氢水对干旱胁迫下大麦种子渗透调节物含量的影响

研究表明,不同浓度的富氢水处理，对干旱胁迫下大麦种子萌发期渗透调节物质含量有较为明显的影响。相比于对照，各浓度富氢水均能显著提高种子中可溶性糖的含量，其中，以25%和50%的富氢水提升效果最佳，可溶性糖含量可达对照的1.36与1.31倍，75%和100%的富氢水处理下，可溶性糖含量则为对照的1.09和1.10倍。随着富氢水浓度的增加，萌发大麦种子中可溶性蛋白含量呈现先上升后下降的趋势，当富氢水浓度为25%时，可溶性蛋白含量与对照相比有显著性升高；当富氢水浓度为50%后，可溶性蛋白含量达到峰值，为对照的1.20倍；而当富氢水浓度达到75%和100%时，可溶性蛋白含量虽有提升，但增幅并不显著。大麦种子中游离脯氨酸含量在50%与75%富氢水处理下，较之对照有显著性增加，分别达到1.33与1.05倍，其余浓度处理后，游离脯氨酸含量无显著性差异。表2

注：图柱上不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

表1 不同浓度富氢水浸种干旱胁迫下大麦种子萌发变化Table 1 Effects of different HRW concentrations on barley seed germination under drought stress

表2 不同浓度富氢水浸种干旱胁迫下大麦种子渗透调节物质变化Table 2 Effects of different HRW concentrations on the content of osmotic regulation substances on barley seed under drought stress

2.3 富氢水对干旱胁迫下大麦种子氧化还原平衡的影响

研究表明，不同浓度富氢水处理可参与调节干旱胁迫下萌发期大麦种子的氧化还原平衡。丙二醛是一种衡量氧化胁迫程度高低的指标，相比于对照，25%、50%、75%的富氢水中丙二醛含量分别降低了14.5%、8.4%和8.6%，100%富氢水中丙二醛含量虽有所降低，但与对照无显著性差异。超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶是重要的抗氧化酶，对维持植物体内氧化还原平衡有重要作用。在富氢水处理下，3种酶的活性均有所升高。其中，超氧化物歧化酶活性仅在25%与75%时有显著性差异，其余处理提升均不显著；过氧化物酶和过氧化氢酶的活性均符合先上升后下降的规律，前者活性在富氢水浓度为50%时最高，25%时次之，分别为对照的1.40倍和1.28倍，浓度为75%和100%时，差异不显著；后者活性在富氢水浓度为50%时最高，75%、25%时次之，分别为对照的2.2倍、1.90倍和1.58倍，100%时则无显著性差异。表3

表3 不同浓度富氢水浸种干旱胁迫下大麦种子丙二醛含量和抗氧化酶活性Table 3 Effects of different HRW concentrations on the content of malondialdehyde and antioxidant enzyme activities of barley seed under drought stress

3 讨 论

3.1 富氢水以浓度依赖的方式促进干旱胁迫下大麦种子的萌发

发芽率、发芽势、发芽指数是衡量发芽质量的常用指标[12]。轻微的干旱胁迫有利于柱花草、洋葱等植物的萌发，而过度的干旱胁迫会显著降低发芽率、发芽势与发芽指数[13, 14]。研究则发现，大麦种子的萌发质量在呈浓度梯度的聚乙二醇-6000溶液中均受到了不同程度的抑制，这与在紫花苜蓿和野生草木犀中的研究结果一致[15,16]。低浓度聚乙二醇-6000处理可增高耐旱性较强茅草的发芽率，而降低干旱敏感茅草的萌发质量[17]。

试验筛选20%聚乙二醇-6000为大麦种子萌发的半致死浓度。富氢水能以浓度依赖的方式缓解该浓度下聚乙二醇-6000对大麦种子萌发的抑制，其中以25%和50%的富氢水溶液处理最佳。在硼、铝等重金属胁迫中，富氢水的作用也表现出了类似的规律[5, 18]，富氢水的促进效应伴随着氢气溶解度的增高而增强。100%富氢水对高盐胁迫下水稻种子的萌发最有利[4]，高浓度富氢水更能提升黄瓜对热胁迫的耐受性[19]。

3.2 富氢水通过提升大麦种子中渗透调节物质含量增强干旱胁迫耐受性

干旱胁迫下，植物体会合成并积累大量可溶性糖与可溶性蛋白以平衡细胞内外水势，缓解缺水对植物生长发育造成的负面影响[11, 20]。富氢水处理可显著增加缺水条件下大麦种子中可溶性糖与可溶性蛋白含量，这与富氢水在盐胁迫与铜胁迫中所起到的作用相一致[4,7]。

物质的累积有利于降低组织内外渗透势，防止细胞脱水甚至死亡，其含量与植物抗逆性强弱成正比[21, 22]；游离脯氨酸含量可作为一种衡量植物所受胁迫程度大小的指标，胁迫程度越重，游离脯氨酸含量越高[20, 23]。研究结果与第一种观点一致，当富氢水浓度为25%与50%时，大麦种子中游离脯氨酸含量最高，该处理下发芽率、发芽势等指标表现最佳，25%、50%富氢水浸种后，大麦种子受到的干旱损伤最小。

3.3 富氢水通过增强抗氧化酶活性缓解干旱胁迫对大麦种子造成的氧化损伤

干旱胁迫会使植物体内产生大量的活性氧，如过氧化氢、羟基自由基、超氧阴离子、氧化硝酸阴离子等。过量的活性氧累积会启动膜脂过氧化作用，造成细胞膜损伤，甚至导致细胞死亡[24, 25]。丙二醛是膜脂过氧化的重要产物，该产物自身过度累积也可对植物产生毒害作用。研究表明，不同浓度富氢水以浓度依赖的方式降低了干旱胁迫下大麦种子中的丙二醛含量，适宜浓度外源供氢有利于缓解干旱胁迫对萌发期大麦造成的氧化损伤。

为了应对逆境条件下活性氧的积累，植物自身可启动氧化保护系统中的酶类物质，如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等，和一些非酶类化合物，如脯氨酸等来抵御与清除活性氧[24]。超氧化物歧化酶可将植物体内的超氧阴离子转化为过氧化氢和水。氢气能够降低miR398a和miR159a的转录本，并上调靶基因OsSOD2与OsGAMYB的表达水平[6]。适宜浓度的富氢水能显著提高植物种子中超氧化物歧化酶的活性，这与上述结果相一致[6]。过氧化物酶和过氧化氢酶能清除植物体内累积的过氧化氢。试验发现25%与50%富氢水可显著提升2种酶的活性，75%富氢水可显著增加过氧化氢酶活性，这与刘丰娇等[20]的研究结果基本相同。此外，羟基自由基、氧化硝酸阴离子也对细胞膜有高度破坏性。氢气可选择性地清除上述2种强毒性活性氧[21]，这可能也是富氢水浸种能够缓解干旱胁迫下大麦种子氧化损伤的原因，但仍需进一步研究验证。

4 结 论

20%聚乙二醇-6000胁迫可对大麦种子萌发造成较大程度的抑制，25%和50%富氢水浸种可以显著改善萌发质量，使大麦的发芽势、发芽率、发芽指数提高。富氢水能增加可溶性蛋白、可溶性糖和游离脯氨酸含量，通过调节细胞和组织的水势平衡增强萌发期大麦种子的抗旱能力；富氢水还能促进大麦种子内超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性的升高，以及时清除活性氧并降低丙二醛含量，缓解干旱胁迫对大麦种子造成的氧化伤害。