低蛋白日粮对湘东黑山羊肉品质及肌源性调节因子基因表达的影响

陈文勋，周 婷，颜琼娴，田丽娜，曹满湖，谭支良，邹爱华

(1.中国科学院 亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，动物营养生理与代谢过程湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125；2.中国科学院大学，北京 100049；3.湖南农业大学 动物科技学院，湖南 长沙 410128；4.桃源县农业综合行政执法局，湖南 常德 415700)

畜禽养殖排泄物中过量的氮排放会对环境造成不利影响，合理降低畜禽日粮蛋白水平可提高氮(N)的利用率，减少N的排放，同时能够节约饲料成本且不影响畜禽正常的生长发育[1]。一般来说，随着日粮N摄入量增加，动物的N排泄量也相应增加，反刍家畜日粮中瘤胃降解蛋白与瘤胃非降解蛋白比例增加也会导致尿N排泄量增多[2-3]。相关研究表明，降低肉牛日粮蛋白水平，同时补充过瘤胃赖氨酸和蛋氨酸可提高其生长性能和氮利用率[4-5]；降低奶牛日粮蛋白水平，补充过瘤胃赖氨酸、蛋氨酸和组氨酸可缓解低蛋白对产奶性能的影响[6]。因此，降低日粮蛋白水平的同时，保持日粮中必需氨基酸的配比平衡，才能提高反刍动物的蛋白质利用率，达到降低氮排放的目的。

日粮中蛋白质水平和能量水平可影响胴体的脂肪沉积和肌肉生长。王东等[7]研究报道，降低育肥猪日粮蛋白水平可改善肉色并提高肌肉粗脂肪含量，进而调节猪肉品质。葛长荣等[8]报道低蛋白水平日粮饲喂乌金猪可获得较好的肉品质，主要表现为肌内脂肪、肌苷酸和肌肉风味物质的增加。藏羊和小尾寒羊饲喂低蛋白日粮，对其背最长肌脂肪含量和肌肉氨基酸含量均有显著影响[9]。

骨骼肌发育依赖于肌源性祖细胞的分化，肌源性祖细胞受肌源性调节因子(MRF)家族的表达调控。一般将 MRFs分为2个功能组：初级 MRFs，包括MYF5和MYOD，它们是骨骼肌成肌细胞形成所必需的；MYF6和MYOG属于次级 MRFs，较晚表达，在肌细胞的分化过程中发挥重要作用。有研究发现，肌肉中MYOG和MYF5二者具有强正相关性(r=0.869)，MYF5和MYF6有反向共表达效应，MYOG和MYOD也有长期的正向共表达效应[10-11]。骨骼肌肌球蛋白可调控轻链编码基因MYL，作为调控骨骼肌发育和影响骨骼肌肉质的候选基因，研究发现，MYL在中国天府山羊的后背最长肌中表达的水平相对较高，但表达量随日龄增长逐渐降低[12]。MRF家族控制肌肉细胞的生长分化，肌纤维的数量和大小也与之相关，因此，MRF家族的表达也对肉质和风味有潜在调节作用[13]。

湘东黑山羊作为湖南省一种具有地方特色、肉质佳的山羊品种，关于低蛋白质水平对其肉品质和MRF家族基因表达的影响研究较少。因此，本试验通过饲喂2种不同蛋白水平日粮，来探索低蛋白日粮对湘东黑山羊肉品质的影响，并通过比较不同部位肌肉的氨基酸和脂肪酸组成和MRF家族基因表达，初步探索蛋白质水平对湘东黑山羊肉品质影响的机制，研究结果可为反刍家畜蛋白质营养研究和节能减排等生产实践提供理论参考和生产依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

本试验选取8月龄左右体质量在(19.6±3.55)kg 的生长期的湘东黑山羊母羊24头，随机分为2组，即正常蛋白组(CON，CP：10.77%)与低蛋白组(LP，CP：5.52%)，每组12头羊，单笼饲养，自由饮水，每天定时(分别在8：30和17：30)饲喂，同时记录每只羊的采食量。试验开始前所有羊统一驱虫(左旋咪唑，8 mg/kg)，试验喂饲周期共70 d，其中预试期为25 d，正试期为45 d，日粮配方见表1。

表1 试验日粮及营养成分(干物质基础)Tab.1 Composition and nutrient level of the experimental diets(DM basis)

1.2 样品采集

试验正试期结束后所有试验羊全部屠宰，采集右侧胴体背最长肌、股外侧肌和半腱肌，剥离肉眼可见的局部脂肪、筋膜后于-20，-80 ℃分别保存一份样本备用，另取一份肌肉样用4%多聚甲醛固定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 胴体特征测定和肉品质评定 屠宰后剥离毛皮，去除头、蹄、尾部和内脏器官后，称量胴体，热胴体产量计算如下：

热胴体产量=热胴体质量(kg)/宰杀前空腹体质量(kg)×100%

①

屠宰率=热胴体质量(kg)/宰杀前的体质量(kg)×100%

②

在胴体左侧第 12 肋骨和第 13 肋骨之间测量背肌(Longissi musthoracis，LT)的宽度和厚度，并且通过以下等式计算眼肌面积：

眼肌面积(cm2)=宽度(cm)×厚度(cm)×0.7

③

收集第 10～12 肋骨的背肌用于 pH 和肉色测定；使用pH计(205，TestoSE&Co，Freiburg，德国)测量 pH45min(宰杀后 45 min的 pH 值)和 pH24h(宰杀后24 h的pH值)，在肌肉的3个不同的位置上进行测量后取平均值；根据色差计法，宰后45 min和24 h使用色差计(CR-400，Konica Minolta Group，Tokyo，日本)测量肌肉样品的 L*(亮度)、a*(红度)和 b*(黄度)值，色度计用标准白板(8 mm 直径孔径，d/0 照明系统)校准，在肌肉的3个不同位置上测量后取平均值；测量失水率，将第8～10肋骨中的约5 g的 LT 肌肉置于10层滤纸之间，以35 kg的负荷按压5 min。

失水率=(压前质量-压后质量)(g)/压前质量(g)×100%

④

1.3.2 肌肉氨基酸与脂肪酸测定 称取 0.2 g冷冻干燥后的肌肉样品，加入干净的安瓿瓶中，再加入6 mol/L的盐酸10 mL，使用酒精喷灯将安瓿瓶密封，110 ℃烘箱水解4 h。双蒸水多次冲洗，定容至100 mL的容量瓶中。取1 mL的定容液使用金属浴70 ℃蒸干，置入1 mL 0.01 mol/L的盐酸溶解管中沉淀，样品过0.22 μmol/L滤膜，上机测定(氨基酸分析仪l-8800，Hitachi，Tokyo，日本)。

称取 0.5 g 冷冻干燥后的肌肉样品，依次添加4 mL二氧化苯-甲基石油醚作为混合溶剂(二氧化苯与甲基石油醚按一定的体积比 1∶1混合)，密闭浸提4 h后，加入4 mL氢氧化钾-无水甲醇溶液(0.4 mol/L)，振荡 3 min后静置30 min。加入超纯水分层，取上层甲醇溶液，加入一定量的氢氧化钾无水硫酸钠，吸去残留的水分。取上清液400 μL，加入600 μL正己烷稀释，0.45 μmol/L滤膜过滤后使用液体进样气相色谱仪测定(安捷伦 7890a，美国)。

1.3.3 肌纤维类型分析 肌纤维类型鉴定使用ATP酶化学染色法，具体方法参考侯普馨[14]的研究。制片完成后树胶封片，显微镜(Leica DM)下100倍镜检拍照，每张切片选取5个视野，每个视野下选取200根肌纤维，使用Image J软件分析肌纤维类型以及横截面积。

1.3.4 肌源性调节因子基因表达 使用TRIzol试剂提取背肌、股外侧肌和半腱肌总RNA，紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和纯度，使用TaKaRa反转录试剂盒(RR047A)将总RNA反转录为cDNA。引物序列见表2。实时荧光定量PCR使用TaKaRa试剂盒(RR820A)，LightCycler480系统，具体试验程序参考杨宏等[15]的研究。以ACTB作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算CON和LP组肌肉生长因子基因相对表达量。

表2 荧光定量 PCR 的引物序列信息Tab.2 Primer sequence information of fluorescence quantitative PCR

1.4 数据处理与统计分析

所有数据采用Excel 2016进行初步整理，在SPSS 25软件中对胴体品质、肌纤维类型、肌肉氨基酸和脂肪酸、基因表达数据利用独立样本t检验进行显著性分析，血液游离氨基酸数据进行重复度量分析(时间与处理之间无交互作用)。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，0.05

2 结果与分析

2.1 低蛋白日粮对湘东黑山羊生长性能和胴体品质的影响

如表3所示，低蛋白日粮对湘东黑山羊终末体质量、平均日增质量均没有明显的差异(P>0.05)，但低蛋白日粮组平均日增质量指标出现了负值，且饲料转化率呈现降低的趋势(P<0.1)，说明低蛋白日粮严重影响湘东黑山羊的饲料转化效率和生长性能。低蛋白组与对照组在胴体质量、屠宰率、眼肌面积和失水率指标上均无显著差异(P>0.05)。肌肉pH值在屠宰后45 min 和24 h 这2个时间点均无显著差异(P>0.05)，肉色a*值与b*值在2个时间点也无显著差异(P>0.05)，但低白蛋白组显著提高了屠宰后24 h 肉色L*值(P<0.05)。

表3 低蛋白日粮对湘东黑山羊胴体品质的影响Tab.3 Effect of low protein diet on the performance and carcass quality of Xiangdong black goats

2.2 低蛋白日粮对骨骼肌肌纤维类型及大小的影响

根据肌纤维染色后颜色的深浅不同，可将其区分为：Ⅰ型(Type Ⅰ，黑色)和Ⅱ型(Type Ⅱ，褐色)2种类型(图1)。如图2所示，Ⅰ型肌纤维和Ⅱ型肌纤维的比例在2组之间均无显著差异(P>0.05)，且低蛋白日粮对Ⅰ型肌纤维横截面积、Ⅱ型肌纤维横截面积均无显著影响(P>0.05)，仅在半腱肌中肌纤维总平均横截面积呈现降低的趋势(0.05

背最长肌(A.对照组；D.低蛋白组)；半腱肌(B.对照组；E.低蛋白组)；股外侧肌(C.对照组；F.低蛋白组)。Longissimus dorsi(A.CON；D.LP)；Semitendinosus(B.CON；E.LP)；Vastus lateralis (C.CON；F.LP).

2.3 低蛋白日粮对肌肉氨基酸组成的影响

如表4所示，低蛋白日粮处理对背最长肌肌肉中的必需氨基酸和非必需氨基酸含量无显著影响(P>0.05)；半腱肌中，低蛋白日粮处理仅显著降低谷氨酸含量(P<0.05)，苏氨酸和丝氨酸的含量呈现下降趋势(0.05

表4 低蛋白日粮对背最长肌、半腱肌和股外侧肌氨基酸组成的影响Tab.4 Effect of low protein diet on amino acid composition of longissimus dorsi，semitendinosus and vastus lateralis g/100g

2.4 低蛋白日粮对肌肉脂肪酸组成的影响

如表5所示，低蛋白日粮仅降低背最长肌中油酸的含量(P<0.05)，而肉豆蔻酸含量呈现升高趋势(0.050.05)；半腱肌中，低蛋白组二十碳二烯酸和二十二烯酸含量显著降低(P<0.05)，总饱和脂肪酸、总单不饱和脂肪酸和总多不饱和脂肪酸含量均无显著差异(P>0.05)；股外侧肌中，低蛋白组总多不饱和脂肪酸含量显著降低(P<0.05)，其中花生四烯酸和油酸含量显著降低(P<0.05)，肉豆蔻酸和亚油酸呈现降低趋势(0.05

表5 低蛋白日粮对背最长肌、半腱肌和股外侧肌脂肪酸组成的影响Tab.5 Effect of low protein diet on fatty acid composition of longissimus dorsi，semitendinosus and vastus lateralis g/100g

A、D.背最长肌；B、E.半腱肌；C、F.股外侧肌；柱状图未标记字母的为差异不显著(P>0.05)。A，D.Longissimus dorsi；B，E.Semitendinosus；C，F.Vastus lateralis；Histogram without superscript letters are not significantly different(P>0.05).

2.5 低蛋白日粮对肌源性调节因子mRNA 表达量的影响

如图3所示，低蛋白日粮对背最长肌MYOD、MYF5、MYF6、MYOZ1、MYL和SIX基因相对表达量均无显著影响(P>0.05)。在半腱肌中，低蛋白组MYOD基因的相对表达量显著降低(P<0.05)，而MYF5、MYF6、MYOZ1、MYL和SIX等基因无显著差异(P>0.05)。在股外侧肌肉中，低蛋白日粮对MYOD、MYF5、MYF6、MYOZ1、MYL和SIX等基因的相对表达量均无显著影响(P>0.05)。

A.背最长肌；B.半腱肌；C.股外侧肌；柱状图未标记记字母的为差异不显著(P>0.05)；标记不同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。A.Longissimus dorsi；B.Semitendinosus；C.Vastus lateralis；Histogram without superscript letters are not significantly different(P>0.05)，with different small letters indicate significant difference(P<0.05).

3 讨论与结论

本试验结果显示，低蛋白日粮组总增质量降低但终末体质量与对照组无显著差异，这与30%采食量限制绵羊以及母牛日增质量的研究结果一致[17-18]。而低蛋白饲粮组平均日增质量出现了负值，也表明了本试验低蛋白水平日粮对湘东黑山羊的生长发育的负面影响。

肌纤维是动物肌肉组织的基本组成物质，出生后随着机体的生长发育，肌肉组织的主要变化体现为肌纤维直径、横截面积和长度的增长[25-27]。动物肌肉的生长主要依靠肌纤维中蛋白质含量的增加。有研究发现，高蛋白水平相比于低蛋白水平肌纤维面积略有增大，高蛋白水平可以更好地促进肌肉的生长[28-29]。本试验中，半腱肌、背最长肌和股外侧肌3个部位纤维类型无显著变化，仅发现半腱肌中肌纤维总平均横截面积有降低的趋势，说明了低蛋白日粮不影响肌纤维类型的转化。半腱肌肌纤维横截面积降低与侯生珍等[27]在藏羔羊中的研究相近，肌纤维面积随蛋白水平提高而增大。

肌肉氨基酸含量是反映肌肉品质的重要指标，其各类氨基酸的含量和比例影响肌肉风味和鲜香味[30-31]。丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸等都是山羊肉类营养和风味的重要前体物[32-33]。本试验结果显示，低蛋白日粮组背肌中各类氨基酸和总氨基酸含量均无显著差异，而在股外侧肌中低蛋白组的谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和总必需氨基酸含量显著降低，低蛋白组的半腱肌中谷氨酸含量显著降低，这也反映了低蛋白日粮导致的肌肉氨基酸沉积减少。本试验中对照组的必需氨基酸含量普遍高于低蛋白组，尤其是在股外侧肌中低蛋白组的4种必需氨基酸和总必需氨基酸含量显著降低，表明在较低蛋白水平下湘东黑山羊肌肉氨基酸分解代谢较多，肌肉营养品质和风味水平降低。肌肉蛋白的分解不仅可以提供能量，分解产生的氨基酸也可以被机体用作合成其他关键新蛋白的原料。本试验中背最长肌、半腱肌和股外侧肌3个部位的氨基酸含量的差异性，也说明了日粮蛋白摄入不足时肌肉组织分解的偏向性，表现为股外侧肌>半腱肌>背最长肌。肌源性决定因子(MYOD)和肌源因子5(MYF5)对肌肉蛋白质合成和肌肉生长具有重要作用[34-35]，本试验中低蛋白组半腱肌MYOD表达量显著降低，间接说明了低蛋白日粮下半腱肌蛋白沉积减少而分解增多。

肌肉脂肪组织和肌肉必需脂肪酸的组成直接影响肌肉的营养品质，决定肌肉组织的氧化稳定性和肌肉组织的坚硬度，从而直接影响肌肉的营养风味、嫩度和颜色[36]。研究发现，提高日粮能量水平和蛋白水平直接导致肌肉中饱和脂肪酸(SFA)含量下降，而单不饱和脂肪酸(MUMA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)含量上升[37-38]。本试验低蛋白组试验结果与以上类似，背最长肌肉豆蔻酸(C14∶0)含量升高，而油酸(C18∶1n9c)含量下降；半腱肌多不饱和脂肪酸(C20∶2、C22∶1n9)含量下降；股外侧肌中，低蛋白日粮处理降低了油酸(C18∶1n9c)、花生四烯酸(C20∶4n6)以及总多不饱和脂肪酸的含量。多不饱和脂肪酸作为必需脂肪酸，对机体免疫和细胞膜功能有积极作用[39]。不饱和脂肪酸在一定程度上与肌肉风味相关，C18∶2n6c、C18∶3n3和C20∶5n3与风味呈负相关，C20∶4与风味呈正相关[40]。本试验结果表明，低蛋白日粮在一定程度上降低了湘东黑山羊肌肉中不饱和脂肪酸的含量，进而影响肌肉风味。

本试验条件下，低蛋白日粮(CP：5.52%)降低饲料转化率，提高屠宰后24 h的肌肉的亮度，但不影响肌纤维类型的转化与横截面积。但蛋白摄入不足会影响减少肌肉中氨基酸的沉积，同时减少多不饱和脂肪酸的沉积，最终影响黑山羊肌肉的风味，在生产上对山羊肉质产生不利影响。