禽致病性大肠杆菌Hcp2b对雏鸡脾脏mRNA表达谱的影响

宋祥军，宋自超，沈 啸，陈 哲，蒋胡艳，侯曼曼，邵 颖，涂 健，祁克宗

(安徽农业大学 兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室，安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室，安徽 合肥 230036)

禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenicE.coli，APEC)是阻碍全球养禽业健康发展的重要的细菌性病原，给养禽业带来巨大的经济损失。APEC致病机理复杂，有多种致病因子介入，分泌系统在APEC引起的疾病中起着重要作用。VI型分泌系统(Type VI secretion systems，T6SS)是一种双层跨膜分泌系统，参与细菌的不同生物过程，在细菌致病过程中发挥重要作用，参与病原体与宿主之间的相互作用、竞争、和细菌的适应性等过程[1]。溶血素共调节蛋白(Hemolysin-coregulated protein，Hcp)是T6SS复合物中的管道型蛋白。Hcp蛋白具有多种功能，敲除Hcp基因后，致病菌的运动、黏附和定植能力都会受到影响[2-3]。其中Hcp1蛋白可以作为水溶性效应物分泌到菌体外面，影响细胞骨架重排、激活凋亡程序并释放炎症因子[4]。

脾脏作为一种机体主要的血液过滤器，它包含B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞(DC)、巨噬细胞和其他细胞亚群，维持它们的组成比和数量，对于改善机体的免疫反应至关重要[5]。尤其是脾脏为动物体内最大的淋巴器官，因为禽类的淋巴管和淋巴结发育不完善，故脾脏在禽类的免疫反应中占有更重要的地位。脾脏的功能有储血、过滤病原、淋巴细胞生成和成熟[6]。因此，当脾脏接触到外来病原体后就会激活自身免疫系统，从过滤的血液中捕获到抗原，以启动抗原特异性免疫反应保护自身健康[7]。

鉴于脾脏在禽类免疫体系中的重要地位，更加充分地了解效应蛋白Hcp在APEC感染雏鸡脾脏后参与的遗传调控，本研究利用兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室前期构建的缺失株Δhcp2b和回复株Chcp2b感染7日龄罗曼雏鸡，检测脾脏组织载菌量及制作病理组织切片，并进行转录组学测序分析hcp2b基因缺失后雏鸡脾脏mRNA水平的变化，旨在为深入探究APEC的致病机制提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株和试验动物 本研究中APEC毒株(AE17)由本实验室分离保存。缺失株Δhcp2b和回复株Chcp2b由本实验室构建保存。上述菌株在Luria-Bertani(LB)固体培养基(含1.5%琼脂)或37 ℃的LB肉汤中生长。根据需要添加氯霉素(30 μg/mL)。从安徽省安禽养殖公司购买了24只1日龄的罗曼雏鸡。

1.1.2 主要试剂与仪器 Total RNA Extractor(TRIzol)、M-MuLV Reverse Transcriptas、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、氯霉素购自上海生工生物有限公司。紫外分光光度仪(WFZ UV-2100)购自上海尤尼柯，荧光定量PCR仪(Step One Plus)购自赛默飞世尔科技，高通量组织研磨仪(SCIENTZ-48)购自宁波新芝。37 ℃恒温培养箱、摇床、超净工作台等仪器由本实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 雏鸡感染 将24只1日龄罗曼雏鸡养至7日龄后随机分成4组，包括3组试验组和1组对照组，其中试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中，分别通过腿部肌肉注射1.0×106cfu/mL(1 mL/只)AE17株菌液、Δhcp2b株菌液和Chcp2b株菌液；对照组的6只雏鸡通过腿部肌肉注射无菌PBS(1 mL/只)。注射24 h后，对4组雏鸡分别进行剖检并无菌收集脾脏组织。

1.2.2 脾脏HE切片制作及观察 将采集到的脾脏组织浸泡于4%的多聚甲醛中固定。清洗后经不同浓度的无水乙醇脱水，二甲苯透明，然后用液体石蜡将组织包埋。再经切片、贴片和烤片后进行HE染色、脱水、透明和封片。石蜡切片制作完成，倒置显微镜下查看雏鸡脾脏组织病变，并保存图片。

1.2.3 雏鸡脾脏组织载菌量的测定 上述方法中采集的脾脏，在24 h感染后，每组分别抽取3只雏鸡采取脾脏进行组织载菌量测定，剖解过程在提前紫外照射0.5 h的超净工作台中进行。取出脾脏组织后，称量组织质量0.1 g，加入0.1 mL的无菌PBS，用高通量组织研磨仪进行研磨，后加无菌PBS至1 mL，涡旋混匀，进行倍比稀释，最后取10 μL悬液采用挂板法进行平板计数，采用2个梯度进行计数，每个梯度3个重复，取平均值。

1.2.4 脾脏转录组学测序及差异表达基因筛选 将上述无菌采集的雏鸡脾脏液氮速冻后用干冰保存运输 ，由杭州联川生物测序公司进行转录组学测序。利用cutadapt排除掉无效reads，并将一系列数据进行综合测评得到有效数据(Valid Data)，使用Hisat对预处理后的有效数据进行对比。以∣log2Foldchange∣≥1，P≤0.05为标准筛选。

1.2.5 实时荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)定量检测mRNAs 采用Real-time PCR技术对上述雏鸡脾脏组织差异表达基因进行了验证。用DNase处理从雏鸡脾脏组织中提取的总RNA，以去除微量DNA。M-MLV 将1 μg RNA样品反转录。利用AccuPower2×GreenstarqPCR主混合物按照20 μL反应体系在Step One Plus实时PCR仪上进行实时PCR，以β-actin作为内参基因测定IL22、TNFRSF6B和TNFRSF8的表达水平。引物如表1所示，以2-ΔΔCt法计算样本间mRNA的相对表达量，t-检验对相对表达量统计分析。数据表示为“平均数±标准差”，P<0.05代表差异显著。

表1 荧光定量PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence of Real time quality PCR

1.3 数据分析

将筛选的差异基因进行GO和KEGG分析并进行超几何检验。统计GO和KEGG数据库中每个条目定位的差异表达基因数量。与整个基因组相比，比对出具有显著富集的差异表达基因GO和KEGG条目。

2 结果与分析

2.1 缺失株Δhcp2b感染雏鸡脾脏组织病理学观察

取试验组Ⅰ(APEC感染组)和试验组Ⅱ(Δhcp2b感染组)脾脏组织制作的石蜡切片观察，结果显示，APEC感染组和Δhcp2b感染组脾脏均出现组织结构疏松，细胞间隙增大，弥散分布红细胞，淋巴细胞减少(图1-A、B)。

A.阳性对照组；B.缺失株Δhcp2b试验组。A.Positive control group；B.Deletion strain Δhcp2b test group.

2.2 组织载菌量试验结果

相同剂量的AE17、Δhcp2b 及Chcp2b菌株感染雏鸡24 h后对各试验组雏鸡脾脏组织进行载菌量检测，结果显示，AE17、Δhcp2b及Chcp2b感染雏鸡脾脏组织载菌量分别是106.15，106.05，106.39cfu/g(图2)，表明Δhcp2b菌株与野生株AE17相比在脾脏的定植能力没有明显差异。

图2 Δhcp2b脾组织载菌量Fig.2 The infections in spleen of Δhcp2b strain

2.3 差异表达基因的筛选结果

为了找出APEC与缺失株Δhcp2b对雏鸡脾脏组织的差异表达基因，本研究通过比较分析了Δhcp2b感染组和APEC对照组在感染24 h的差异表达水平，以∣log2Foldchange∣≥1，P≤0.05为筛选标准，缺失株Δhcp2b得到515个差异表达基因，其中330个基因下调表达，185个基因上调表达(图3、表2)。

红色表示差异表达基因上调；蓝色表示差异表达基因下调；灰色为无变化的差异表达基因。

表2 hcp2b缺失株差异表达基因部分差异表达基因Tab.2 Differentially expressed genes of hcp2b deleted strains partially expressed genes

2.4 Real-time PCR验证差异表达基因

利用Real-time PCR对IL-22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因进行验证，如图4所示，IL22、TNFRSF6B、TNFRSF8这3个基因均表达下调，Real-time PCR检测结果与RNA-Seq数据表达量变化趋势一致。

图4 荧光定量PCR验证Fig.4 Real-time quality PCR verification

2.5 GO功能分析结果

GO分析发现，感染24 h雏鸡脾脏差异基因主要集中在细胞外间隙、细胞外基质的组织、膜、膜的组成部分、免疫反应、内质网腔和细胞外基质等(图5)。

图5 hcp2b缺失株显著富集的GO通路Fig.5 The most significantly enriched GO pathway after hcp2b deletion

2.6 KEGG通路富集分析结果

KEGG分析发现，感染24 h时雏鸡脾脏差异基因主要汇集在内质网中的蛋白质加工、细胞因子-细胞因子受体的相互作用、细胞黏附分子(CAMs)等(图6)。

图6 hcp2b缺失株差异表达基因KEGG通路富集Fig.6 KEGG functional enrichment of differentially expressed genes of hcp2b deletion strain

3 结论与讨论

溶血素共调节蛋白(Hcp)不但是T6SS复合物中的管道型蛋白，也是致病过程中发挥作用的效应蛋白[8-9]。有研究发现，霍乱弧菌、柠檬酸杆菌、沙门氏菌、类鼻疽假单胞菌等病原菌的Hcp效应蛋白影响病原菌的黏附入侵、致病性、宿主免疫反应等多种过程[10]，而且不同类型的Hcp蛋白作用也不尽相同。猪肠外致病性大肠杆菌中Hcp2介导细菌竞争，而Hcp1和Hcp3介导细菌与真核细胞的互作[11]。当Hcp蛋白缺失后，副溶血性弧菌对Hela细胞黏附能力降低[12]。本实验室先前的研究中也发现，hcp2b影响雏鸡气管黏膜细胞因子-细胞因子受体相互作用通路[13]。为了更好地研究基因hcp2b在APEC致病中的作用，本研究将感染野生株AE17和缺失株Δhcp2b的雏鸡脾脏进行组织切片观察并进行组织载菌量测算，结果显示，二者脾脏组织均出现组织结构疏松，细胞间隙增大，弥散分布红细胞，淋巴细胞减少。且野生株AE17和缺失株Δhcp2b在脾脏组织载菌量中差异不显著。在黄超等[14]研究报道中，感染大肠杆菌的病死鸡显微观察脾脏组织间隙增大，脾脏淋巴细胞稀疏，与本试验结果相似。而试验组与对照组并没有表现出太大差异，推测和组织载菌量差异不大相关。在彭颖[15]研究中发现，在猪源性大肠杆菌hcp2缺失株中脾脏的组织载菌量表现为显著减少。而本研究中脾脏的组织载菌量却差异不显著，依据机体脾脏组织的菌体定植是由血液传播，推测可能是因为感染动物机体血液中菌体存活量差异造成的。本试验基于载菌量无显著变化的基础上，研究hcp基因缺失对脾脏转录组学的影响。

将缺失株Δhcp2b与野生株AE17脾脏组织进行RNA-Seq测序分析发现，差异表达基因主要汇聚在内质网中的蛋白质加工、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、细胞黏附分子(CAMs)等。其中IL-1R1和IL-1R2表达下调。已有文献报道，白细胞介素-1(IL-1)是天然免疫和炎症的中枢介质[16]，在IL-1信号通路的启动中IL-1R1起着重要作用[17]，白细胞介素-22(IL-22)保护机体并促进炎症应答的功能。以往研究证实，肺炎克雷伯菌感染小鼠后肺脏和脾脏中IL-22水平下降，细菌载菌量明显升高[18]。本研究中，缺失株Δhcp2b感染雏鸡脾脏导致IL-22的表达下调，但组织载菌量却没有明显增多。说明IL-22在APEC感染的雏鸡脾脏中具体作用有待更深入研究。

GO功能分析显示，差异表达基因主要富集在膜、膜的组成。KEGG通路富集分析显示，差异表达基因最显著富集在内质网蛋白质加工过程。在真核细胞中内质网膜约占细胞总膜面积的1/2[19]。在机体抵御病原体侵入中需要大量蛋白质，但是想要生成某种确定的蛋白质，内质网准确折叠的成功率很低，继而将引发内质网应激反应。细胞相应的将发动未折叠蛋白反应(UPR)来减少内质网压力[20]。肌醇必需酶1(IRE1)参与UPR信号通路，活化的XBP1(XBP1s)可缓解内质网应激，而XBP1的活化由IRE1完成[21]。当hcp2b基因缺失后，XBP1基因表达下调，内质网应激加重，UPR过程也会受到影响。另外，内质网的质量控制系统确保只有正确折叠的蛋白质通过识别保留在细胞中和丢弃错误折叠或未组装的蛋白质，这一过程被称为内质网相关降解(ERAD)，ERAD系统由多个内质网膜相关蛋白和腔蛋白组成的复合体协同发挥作用。DERL3是ERAD复合物转换中不可或缺的组成部分[22]。EDEM可以加速糖蛋白ERAD的表达[23]。EDEM3是EDEM的同系物[24]。DERL3基因表达下调时，ERAD系统复合物转换受到影响，EDEM3基因出现表达下调时则会减缓ERAD进程。这些因素综合影响内质网的功能，进而可能影响免疫机制作用的发挥。此外，IL-22结合蛋白亚型有IL-22BPi1、IL-22BPi2和IL-22BPi3，其中IL-22BPi1具有诱导UPR反应的能力，导致GRP78和GRP94内质网伴侣蛋白水平升高[25]。GRP78和GRP94均为ERAD过程中重要的内质网伴侣蛋白[26-27]。这也表明hcp2b基因可以通过对IL-22基因表达量的调控间接影响免疫反应的功能。

综上所述，缺失株Δhcp2b感染雏鸡脾脏后，诱导了雏鸡脾脏内质网蛋白质加工通路基因的差异表达。观察到hcp2b参与调节IL22、IL1R1、XBP1、EDEM3、DERL3基因的表达，提示hcp2b在APEC感染过程中参与了细菌与宿主的相互作用。研究结果不仅为明确hcp2b参与APEC感染过程提供证据，也为研究APEC感染雏鸡脾脏的致病机制提供参考。