向日葵列当枯斑病病原菌的分离鉴定及致病力分化

张 键，王 娜，刘志达，包婷婷，张之为，云晓鹏，石必显，张 恒，陈贵红，陈燕芳，赵 君

(1.内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；3.新疆农业科学院 经济作物研究所，新疆 乌鲁木齐 830091；4.新疆生产建设兵团第十师农业科学研究所，新疆 北屯 836099)

向日葵列当(OrobanchecumanaWallr)又称高加索列当、毒根草、兔子拐棍，属列当科(Orobanchaceae)列当属(Orobanche)的一年生寄生性草本植物[1]，主要为害向日葵、瓜类、茄科和豆类等作物[2]。向日葵列当没有真正的根，也没有叶片进行有效的光合作用，它们发育出特殊的入侵器官(吸器)，穿透寄主的根部表皮，直接将其与寄主作物的维管系统连接起来，引导水分、营养物质和其他分子从寄主流向自身，从而破坏寄主的生长发育[3]。向日葵苗期被列当寄生后，不能形成花盘；生长后期被寄生后，植株生长缓慢、茎秆矮化，叶片小而发黄，花盘瘦小，籽粒不饱满或空秕，产量、品质和含油率大幅降低[4-5]。已有的研究结果表明，向日葵被10株以上的列当寄生时，秕粒增加50%以上[6]，受其危害轻者减产20%左右，重者可达50% 以上[7]。

我国于1959年首次报道了黑龙江省肇州县向日葵列当的发生[8]。此后，随着向日葵大面积连作、引种混乱、管理粗放，导致列当在全国各向日葵种植地的发生和危害程度逐年加重[9]。目前，除宁夏向日葵产区外，几乎我国向日葵的种植区都有列当的发生，但以内蒙古和新疆发生最为严重。列当作为向日葵的一种寄生性种子植物也时有病害发生，如李超[10]鉴定出引起瓜列当根腐病的茄病镰刀菌(F.solani)、木贼镰刀菌(F.equiseti)、变红镰刀菌(F.lateritium)；丁丽丽等[11]报道了尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、茄病镰刀菌和禾谷镰刀菌(F.cerealis)可以引起新疆向日葵列当的茎腐病；徐东升[12]对田间采集的向日葵列当病样进行分离和鉴定，确定黄瓜枯萎菌(Plectosphaellacucumerina)是引起向日葵列当枯斑病的病原菌。此外，列当还能够被潜叶蝇(Phytomyzaorobanchia)所寄生，通过在列当茎秆中产卵孵化形成幼虫，幼虫的取食造成了列当茎秆的腐烂和折断[13]。

内蒙古农业大学分子植物病理实验室在向日葵列当发生危害调查以及取样过程中，发现在近土表列当的茎秆上有黑褐色条形病斑的形成。列当枯斑病株在向日葵不同种植区都有发生，但发生程度有所不同。发病初期病斑较小，随着时间的推移病斑逐渐纵向和横向扩展蔓延。相邻病斑还能融合形成环绕茎秆的大病斑，从而导致列当茎秆的枯死。因此，本试验对采自内蒙古、河北和新疆共11个地点29份向日葵列当枯斑病的病样进行了分离和鉴定，明确了引起向日葵列当枯斑病病原菌的种类，并对分离到的病原菌的致病力分化进行了研究，为向日葵列当生防菌的开发提供一定基础数据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试的向日葵列当枯斑病样本采集地点信息见表1，从内蒙古、新疆和河北3个地区共采集样本29份，其中内蒙古地区样本共计23份，分别从巴彦淖尔市、呼和浩特市、鄂尔多斯市及乌兰察布市地块中采集得到。供试向日葵列当种子采自内蒙古呼和浩特市武川县大豆铺村的向日葵地块，经鉴定生理小种为G小种。

表1 供试样本信息Tab.1 Test samples information

1.2 供试培养基及试剂

水琼脂培养基(Water Agar，WA)：琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL定容，121 ℃高温灭菌30 min；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g、水1 000 mL，121 ℃高温灭菌30 min；麦麸培养基：每60 g麦麸加入自来水40 mL，搅拌均匀分装于300 mL的罐头瓶中，121 ℃高温灭菌25 min，灭2次。

供试试剂：CTAB、氯仿、异戊醇、异丙醇，购自北京全式金生物技术有限公司；10×Taq缓冲液、dNTPs、Taq酶和DL2000分子量标准，购自天根生物科技有限公司；卡那霉素购自AMRESCO公司；聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物，由北京厚生博泰科技有限公司合成。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌的分离纯化 将发病的向日葵列当茎部洗净后从病斑的病健交界处切取0.3 cm×0.3 cm大小的薄片，用75%酒精消毒30 s后用无菌滤纸吸干；然后再用0.1%次氯酸钠浸泡3 min后用无菌水冲洗3次。待发病组织晾干后平铺在添加有卡那霉素的WA培养基平板上。每个培养皿上放置5片，置于25 ℃恒温培养。待发病组织四周长出菌丝后，用接种针在周围的菌落边缘挑取带有菌丝的培养基小块，转接到PDA培养基上进行培养。待菌落长至培养皿2/3时，采用平板稀释法进行单孢分离，并获得纯培养。纯培养分离物经茎秆接种法进行回接鉴定，7 d后观察病斑扩展情况，并从病健交界处进行病原物的再分离。

1.3.2 病原菌的形态学鉴定 将单孢后的纯培养物接种到PDA培养基上，25 ℃下恒温培养，待菌丝体长满皿后，观察菌落的质地、颜色、基质颜色等。挑取菌落制片后在显微镜下观察菌丝体和孢子的形态。依据形态学观察结果对分离病原物进行初步的鉴定。

1.3.3 病原菌的分子鉴定 采用CTAB法提取分离物纯培养的基因组DNA[14]，利用镰刀菌EF1-α基因特异性引物EF1/EF2进行PCR[15]，引物为EF1：ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGA；EF2：GGA(G/A)GTACCAGT(GC)ATCATGTT。50 μL PCR反应体系为：引物EF1/EF2各1 μL(10 μmol/L)，10×TaqBuffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，TaqDNA Polymerase 1 μL，DNA模板100 ng，其余用ddH2O补足。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京厚生博泰公司测序。测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，根据比对结果确定分离物的分类地位。

根据NCBI网站上Blast比对结果，从GenBank数据库获得同源性较高的菌株序列尖孢镰刀菌(GenBank登录号：MK059958.1)、茄病镰刀菌(GenBank登录号：MN650110.1)、木贼镰刀菌(GenBank登录号：KT213293.1)、轮枝镰刀菌(GenBank登录号：KF715264.1)、层出镰刀菌(GenBank登录号：JX268969.1)和大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae,GenBank登录号：GU461623.1)，用DNAMAN进行序列比对分析，构建基于EF-1α基因序列的系统发育树。

1.3.4 病原菌的回接鉴定与致病力测定 回接鉴定：①将基质、蛭石、沙子按2∶1∶1的比例充分混匀配比成培养土。再按照培养土∶列当种子=500 g∶0.15 g配置接种土。在营养钵中先装入1/3的培养土，然后装入1/3的接种土，最后再装上1/3的培养土，后用水浇透备用。②将向日葵种子(LD5009)开口向下竖直插入到浸湿的土壤中，再在上面覆盖一层营养基质，以刚好盖住向日葵种子为宜。将上述营养钵置于温室中按时间进行浇水，70 d后开始在列当茎秆上进行人工接种。③在列当茎秆上(地上部5～10 cm)用灭菌牙签刺出伤口。打取PDA平板上培养7 d的菌饼(5 mm)，将带有菌丝的培养基面朝向茎秆一面紧贴在伤口位置，并用保鲜膜将接种的PDA菌块紧紧裹在茎秆上。用没有接菌的PDA培养基作为对照。每个菌种分别接5株列当，7 d后观察病斑的扩展情况。

病原菌分生孢子液的制备：将29株列当枯斑病病原菌经PDA培养基活化培养5～7 d后，用内径8 mm的灭菌打孔器在菌株边缘打出菌饼，接入麦麸培养基，25 ℃培养5～7 d。用无菌水冲洗麦麸培养基，4层灭菌纱布过滤后获得分生孢子液。用血球计数板计数，将分生孢子液的浓度调至1.0×107个分生孢子/mL后备用。

病原菌在列当上的致病力测定：列当的种植参照1.3.4回接鉴定的方法。列当生长70 d后，在列当茎秆上(地上部5～10 cm)用灭菌牙签在叶柄基部刺出伤口，将准备好的分生孢子液20 μL滴在叶柄基部，取适量脱脂棉，用保鲜膜裹在茎秆接种部位上，以无菌水作为对照。接种后的植株置于22～23 ℃温室条件下进行继续培养。每个菌株分别接3株列当，7 d后观察病斑的扩展情况。

病原菌在向日葵上的致病力测定：向日葵种子(LD5009)播种到装有灭菌土的营养钵中，待长至2～4片真叶时，用灭菌牙签在中部叶柄基部刺出伤口，将准备好的分生孢子液20 μL滴在叶柄基部，取适量脱脂棉，用保鲜膜裹在茎秆接种部位上，以无菌水作为对照。接种后的植株置于22～23 ℃温室条件下进行继续培养。每个菌株分别接3株向日葵，14 d后观察病斑的扩展情况。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离和回接鉴定

内蒙古、河北和新疆11个不同地区采集的列当枯斑病样本中共分离获29株纯培养的分离物。依据分离物在PDA培养基的菌落形态以及分生孢子形态可分为5种类型(图1)。

A.菌落正面；B.菌落背面；C.分生孢子形态；D.再分离菌株的菌落形态。A.Front of the colony；B.Back of the colony；C.Conidia morphology；D.Colony morphology of the re-isolated strain.

第1类以GHC1-2为代表的分离物气生菌丝呈白色致密丝绒状，生长3 d后，基物表面由白色转紫色，有许多小型分生孢子，卵圆形，大型分生孢子为镰刀形，大小为15.72～39.89 μm×5.12～13.46 μm，共有16个分离物；第2类以XHZ1-7为代表的分离物气生菌丝白色薄绒状，边缘整齐，基物表面白色，背面白色至淡黄色，孢子量多，分生孢子较大呈镰刀形，大小为35.53～44.75 μm×6.30～15.65 μm，两端较钝，极少见小型分生孢子，共有8个分离物；第3类以XGD3-13为代表的分离物气生菌丝白色棉絮状，边缘不规则，基物表面和背面都为白色，大型分生孢子镰刀形，孢子大小为37.16～53.50 μm×8.83～16.33 μm，数量多，两端较尖，厚垣孢子圆形，串生，共有3个分离物；第4类以KBX-2为代表的分离物气生菌丝白色棉絮状，基物表面中央呈淡黄色，分生孢子长椭圆形，大小为16.10～22.50 μm×10.04～17.59 μm；第5类以XGD-1为代表的分离物气生菌丝绒状，基物表面白色，背面淡黄色。小型分生孢子数量多，椭圆形或卵圆形，大型分生孢子镰刀形，大小为16.77～20.15 μm×5.62～9.51 μm。

将29株分离物经茎秆接种法回接至列当，7 d后观察发现，29株分离物均能侵染列当，并形成与田间症状一致的黑褐色条形病斑(图2)。对回接后的发病列当进行病原物的再分离，均能分离到与接种物形态一致的分离物(图1-D)。因此，确定分离到的29株分离物为引起向日葵列当枯斑病的病原菌。

A.田间发病病斑；B.分离物回接后发病情况。A.Disease spots in the field；B.The incidence of the disease after the separations were reconnected.

2.2 病原菌的分子鉴定

以29株分离物DNA为模板，用EF-1α引物进行PCR扩增，扩增片段经测序后在NCBI网站上进行Blast比对，结果表明，29株分离物分别属于5个种(图3、表2)。新疆北屯农十师183团、内蒙古呼和浩特市武川县西海子村和乌兰察布市四子王旗公合成村的样本中都获得2种病原物，鉴定为尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌；内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗西小召镇、乌兰察布市化德县105省道边和鄂尔多斯市东胜区都获得1种病原物，为尖孢镰刀菌；内蒙古乌兰察布市四子王旗西圪旦村样本中分别获得3种病原物，分别为木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌和层出镰刀菌；内蒙古巴彦淖尔市五原县葵博园样本中分离得到2种病原物，分别为木贼镰刀菌和尖孢镰刀菌；而新疆北屯农十师188团、内蒙古巴彦淖尔市临河区永利村和河北省张家口市康保县样本中都分别获得1种病原物，分别为茄病镰刀菌、木贼镰刀菌和轮枝镰刀菌(表2)。

A.EF1-α引物PCR 扩增电泳：M.DL2000 Marker;1—8.随机8株菌株;+.阳性对照；-.阴性对照。B.菌株GHC 1-2序列比对结果。A.The electrophoresis diagram of PCR amplification by EF1-α primer：M.DL2000 Marker；1—8.Random 8 strains；+.Positive control；-.Negative control.B.Strain GHC 1-2 sequence alignment results.

表2 列当枯斑病病原菌分子鉴定Tab.2 Molecular identification results of pathogens of broomrape necrotic spot

2.3 病原菌的遗传聚类分析

为了确定分离获得的镰刀属病原物的遗传距离，将上述病原物与从GenBank中来源于不同寄主的镰刀菌以及大丽轮枝菌进行遗传聚类分析，结果表明，所有镰刀属病原物被划分为5个类群，分别是尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、层出镰刀菌、木贼镰刀菌、茄病镰刀菌。其中，茄病镰刀菌与尖孢镰刀菌的遗传距离最远，与木贼镰刀菌遗传距离最近；而木贼镰刀菌单独聚为一支，和层出镰刀菌的遗传距离相对较近；而尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌与层出镰刀菌的遗传距离最近，单独聚为一个遗传分支(图4)。

图4 镰刀菌属不同种的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of different species of Fusarium

2.4 病菌的致病力分化

采用分生孢子液定量接种法，将枯斑病病原菌分别接种于列当和向日葵茎秆上，病斑大小统计结果见表3。结果表明，镰刀菌属种内不同菌株间的致病力存在显著差异，对列当而言，16株尖孢镰刀菌中致病力最强的是菌株GHC 1-2和XXZ-9，病斑长度达4.60 cm和4.57 cm，而致病力最弱的菌株WYKBY-5病斑长度仅为0.80 cm，相差近4.00 cm；3株木贼镰刀菌中，YL-1和WYKBY-2分别为致病力最强和最弱菌株，病斑长度分别为2.93，0.83 cm；茄病镰刀菌的种内差异相对较小，8株菌中致病力最强的XHZ 1-7和致病力最弱的XHZ 1-2病斑长度仅相差1.47 cm；对向日葵而言，16株尖孢镰刀菌中致病力最强的是菌株XXZ-13，致病力最弱的是菌株HD 1-1，病斑长度仅为0.23 cm；茄病镰刀菌8株菌中致病力最强的是菌株183 2-4，病斑长度为1.23 cm，其余菌株病斑长度为0.37～0.73 cm；3株木贼镰刀菌中，WYKBY-2菌株致病力最强，病斑长度为0.83 cm，YL-1菌株致病力最弱，病斑长度为0.37 cm(表3)。总体来看，茄病镰刀菌和木贼镰刀菌的种内差异小于尖孢镰刀菌。

表3 枯斑病菌对向日葵列当和向日葵的致病力Tab.3 The pathogenicity of pathogens on broomrape and sunflower cm

相较于列当，29株枯斑病菌对向日葵的致病力整体偏弱，病斑长度介于0.23～2.33 cm，其中病斑长度小于0.50 cm的菌株有11株；而在列当茎秆上，病斑从接种部位纵向扩展，随着时间的推移形成环绕茎秆的大的黑褐色病斑，整体致病力表现较强，病斑长度介于0.80～4.60 cm，病斑长度超过3.50 cm的菌株有6株。其中尖孢镰刀菌的菌株GHC 1-2和HD 1-1在向日葵上病斑长度较小，仅为0.40，0.23 cm，在列当上的病斑长度较大，为4.60，4.17 cm；其次为菌株XXZ-9在向日葵上形成的病斑长度较小，仅为 0.83 cm，而在列当上形成的病斑长度较大，为4.57 cm，其在列当上的致病力仅次于菌株GHC 1-2。通过在列当和向日葵上病斑大小的比较，共筛选得到3株在向日葵上致病力弱但列当上致病力强的枯斑病菌，它们分别是尖孢镰刀菌的GHC 1-2、XXZ-9和HD 1-1(图5)。

A.病原菌在列当上的致病情况；B.病原菌在向日葵上的致病情况。A.The pathogenic of pathogens on sunflower broomrape；B.The pathogenic of pathogens on sunflower.

3 结论与讨论

本研究利用柯赫氏法从内蒙古、河北和新疆共11个不同地点29份样本中鉴定出的5种镰刀菌属不同的种，即尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌、轮枝镰刀菌和层出镰刀菌，其中尖孢镰刀菌是引起向日葵列当枯斑病菌的优势种。这一结果和国内的研究者从田间采集发病列当植株分离获得的多种镰刀菌菌株的结果相一致，如李超[10]鉴定出茄病镰刀菌、木贼镰刀菌、变红镰刀菌是引起瓜列当根腐病的主要致病菌，并从中筛选出7株强致病力菌株作为生防菌进行安全性评价；丁丽丽等[11]证明了从向日葵列当上分离得到尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和禾谷镰刀菌是引起新疆向日葵列当茎腐病的主要致病菌；何伟等[16]对新疆加工番茄分枝列当的病样进行了分离鉴定，发现尖孢镰刀菌对分枝列当有较强致病力。而上述报道中从列当病样中分离获得的变红镰刀菌和禾谷镰刀菌在本研究的样本中没有分离得到，本研究中所分离到的层出镰刀菌和轮枝镰刀菌也未见有过相关的报道。

为了进一步研究29株菌株分别在向日葵和列当上的致病性，本研究采用分生孢子液定量接种叶柄和茎秆交界处的方法进行向日葵和列当的致病性评价，将镰刀菌菌株分别接种于向日葵和列当后，镰刀菌均同时能够侵染向日葵和列当，但致病力存在明显的差异，都表现出在其分离寄主上致病力强于其他寄主作物的特性。对供试菌株在向日葵和列当上的致病力分化进行研究，结果表明，从29株枯斑病菌中筛选出3株在向日葵上致病力较弱，但在列当上致病力较强的菌株，分别为尖孢镰刀菌的GHC 1-2、XXZ-9和HD 1-1，这些菌株具有开发为防控列当，生防菌株的潜力。国内外很多研究者也发现，镰刀菌可以作为杂草的重要病原菌对杂草进行防控，王亚娇等[17]从感病弯管列当上分离得到20株镰刀菌，其中尖孢镰刀菌 Br-2能够有效抑制弯管列当种子萌芽，抑制率可达 71.79%；孔令晓等[18]分离的致病镰刀菌L2菌株，能通过损伤芽管抑制列当种子萌发；Thomas等[19]研究发现，尖孢镰刀菌能够在向日葵列当地下生长阶段进行侵染，显著降低列当种子的萌芽和寄生率；吴元华等[20]利用硫磺调节土壤酸碱度的基础上，施用生防镰刀菌可推迟向日葵列当出土3 d，对烟田向日葵列当防效达62.44%；而Chen等[21]筛选的链霉菌(Streptomycesenissocaesilis)能够抑制向日葵列当种子萌芽，对列当的防治效果可达 47%；Thomas等[22]报道利用尖孢镰刀菌FoxyⅠ和Foxy Ⅱ的孢子悬浮液作为生防菌对向日葵列当、锯齿列当和分枝列当进行防控；Müller-Stöver 等[23]制备的海藻酸钠镰刀生防菌颗粒则是通过侵染列当植株茎部发病而达到防治列当的目的。本研究筛选到的3株镰刀菌对营养要求不严，容易培养，还可在促孢培养基上形成大量的孢子，所以认为这些菌株可以作为有潜力的生防菌用于防控列当对向日葵的寄生。但由于许多镰刀菌也是农作物的重要病原菌，因此还需进一步考虑筛选用作生防的菌株对作物的安全性。