山药DoIPTs基因克隆及珠芽发芽期表达分析

唐文芳，徐升胜，段延碧，龙雯虹，杨荣萍，张雪梅，孟金贵

(1.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 农科教学实验中心，云南 昆明 650201；3.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201)

山药(DioscoreaoppositaThunb)为薯蓣科植物，地下块茎可作为药食同源性材料[1]。细胞分裂素(Cytokinins，CTK)是重要的植物激素，在植物生长发育过程中发挥关键作用[2]。异戊二烯基是细胞分裂素生物合成的前体[3]，异戊烯基转移酶(Isopentenyl transferase，IPT)是细胞分裂素生物合成的限速酶[4]，控制细胞分裂素生物合成时第一步的速度。在玉米籽粒发育中，IPT基因表达对细胞分裂素合成起主要作用，从而影响籽粒的发育[5]。MdIPT5a过量表达时烟草组培苗不定芽增多，即IPT基因表达上调时烟草组培苗发芽数增加[6]。拟南芥IPT基因启动子序列中MGSA基序与CaMV35S启动子元素融合，促使报告基因在精子细胞中表达，选择性活化可能是开花植物精细胞基因表达调控的共同机制，IPT基因启动子序列在精细胞基因表达调控中发挥作用[7]。因此，克隆植物的异戊烯基转移酶基因，获取基因信息及其表达情况对研究植物的生长发育至关重要。本研究将克隆山药异戊烯基转移酶基因，并研究该基因在珠芽发芽期的表达规律，为今后研究该基因的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料准备

采集牛尾山药嫩叶存于-80 ℃冰箱，用以基因克隆。

将生长成熟的珠芽置于22 ℃、相对湿度50%、光照强度2 500 lx、光照时间为12 h/d的光照培养箱中。分别在珠芽刚采收时、半休眠时(采收后30 d)以及萌芽(第2年春天顶芽达0.5 cm)时，随机取5粒珠芽，切取珠芽近发芽端的表皮混合，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存，研究珠芽在利用内部含水量发芽时基因表达量的变化。

珠芽收获60 d后，分别用5，25，45，65，85 mg/L的多效唑(Paclobutrazol，PP333)(配制PP333溶液时为便于多效唑溶解，先用2 mL甲醇溶解多效唑干粉，再用蒸馏水定容)浸泡珠芽24 h，然后用清水洗干净，置于潮湿的含水量约20%蛭石基质中，放到22 ℃、光照强度2 500 lx、光照时间为12 h/d的光照培养箱中培养。清水处理为对照。多效唑处理前第1次取样，以后分别在处理后第14，28，42，56天取样。每次随机取5粒珠芽，切取珠芽近发芽端的表皮混合，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存以备研究多效唑处理后基因表达的变化。

1.2 山药总RNA提取和反转录

用快速通用植物RNA提取试剂盒提取山药总RNA，用无RNA酶消化残余的DNA后迅速冷冻保存于-80 ℃环境；通过无RNA酶的琼脂糖凝胶电泳检查核酸样本的完整性；采用Nanodrop微量分光光度计测定样品A260和A280值，计算RNA浓度(A260/280)。用反转录试剂盒合成cDNA第一条链，保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.3 山药DoIPTs克隆与测序

根据山药转录组数据设计RT-PCR与RACE引物(表1)，RACE克隆参照SMARTer®RACE 5′/3′Kit User Manual方法进行反转录与扩增。中间片段以叶片总RNA反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增，反应总体系和反应程序参照试剂盒参数设置。对分子量合格的PCR 产物进行纯化回收，连入pMD18-T 载体，转化大肠杆菌DH5α感受态，并进行蓝白斑筛选，将获得带有目的产物的阳性克隆质粒进行测序。引物合成及核酸测序由昆明硕擎生物技术有限公司完成。目的片段用DNAMAN 2.0软件进行拼接，从而获得基因序列全长。

表1 PCR引物Tab.1 Primers used for PCR

1.4 DoIPTs生物信息学分析

用NCBI-Blast核酸比对基因序列的同源性，目的基因序列多重比较分析基因间的相似性；用NCBI的ORF Finder和Conserved Domains在线网站分别进行开放阅读框(Open reading frame，ORF)和保守结构域分析；用ExPASy服务器上的Protparam、ProtScale 进行蛋白质理化性质及亲疏水性预测；使用在线工具TMHMM Serverv 2.0分析蛋白的跨膜区；使用SignalP软件对蛋白的信号肽进行分析；利用SOPMA和SWISS-MODEL网站程序预测分析蛋白的二级结构和三级结构；下载与目标序列相似性较高的氨基酸序列进行多重比较分析，用ClustalX和MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.5 珠芽发芽期DoIPTs基因的表达分析

2 结果与分析

2.1 获得总RNA和cDNA序列分析

山药叶片总RNA提取后，总RNA无降解完整性好(图1-A)，总RNA浓度为486.759 ng/μL，A260/230=1.873，A260/280=2.016，说明样本RNA符合要求可用于后续试验。

RNA逆转录扩增拼接，最终获得3条核酸长依次为：1 398，1 044，1 349 bp，拼接后的3个基因经凝胶电泳验证合格(图 1-B)，依次命名为：DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b。

对目的基因进行Blast比较，发现3个基因的核酸序列相似性为38.33%。DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b的ORF全长依次为1 137，861，1 011 bp，对应编码378，286，336 aa(图1-C)。DoIPT1s的GenBank登录号依次为：MW353160、MW353016、MW353017。

图1 RNA、DoIPTs全长凝胶电泳图及DoIPTs基因的ORF编码区域Fig.1 Gel electrophoresis map of RNA，DoIPTs full-length，and ORF encoding region of DoIPTs gene

本研究得到的DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b核苷酸序列与冈比亚白山药(D.rotundata)基因组的3条序列(序列登录号分别是BDML01001166.1、BLBR01000012.1和BLBR01000019.1)的一致性分别为92.00%，96.00%和93.00%。DoIPT5a的核苷酸序列与冈比亚白山药DcIPT3基因mRNA序列(登录号：XM_039280767.1)和基因组序列(登录号：BLBR01000012.1)的同源性最高，达96.09%。DoIPT1和DoIPT5a与拟南芥AtIPT5基因的mRNA序列(登录号：NM_001343585.1)同源性分别为75.00%，70.00%；DoIPT5b与拟南芥AtIPT7基因的mRNA序列(登录号：AB062613.1)同源性达73.61%。

2.2 DoIPTs氨基酸信息预测结果

ExPASy在线分析DoIPTs氨基酸序列，可知DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b的蛋白分子质量为 41.593 94，31.479 24，37.269 81 ku，理论等电点为8.53，5.13，5.11，(Asp + Glu)负电荷残基总数47，42，47，(Arg + Lys)正电荷残基总数 51，34，35；蛋白的脂肪指数是81.38，97.80，93.15，不稳定指数依次为34.92，36.43，37.29，脂肪指数高于不稳定指数，表明DoIPT1蛋白为不稳定碱性蛋白，DoIPT5a和DoIPT5b蛋白为不稳定酸性蛋白。DoIPTs蛋白的总体平均亲水性GRAVY值依次为：-0.398，-0.077，-0.089，表明DoIPTs蛋白为亲水性蛋白；DoIPTs蛋白均位于膜外，为外在膜蛋白；DoIPT1和DoIPT5a不存在信号肽，DoIPT5b存在2个信号肽(图2)。

图2 DoIPTs氨基酸的信号肽Fig.2 Signal peptide of DoIPTs amino acids

SOPMA预测蛋白的二级结构结果显示，DoIPTs蛋白结构具有相同的α-螺旋、β-转角、延伸链和无规卷曲元件，DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b的α-螺旋所占百分比依次为50.00%，43.45%，48.94%，延伸链所占百分比依次为13.99%，13.10%，10.58%，β-转角所占百分比依次为9.09%，10.12%，7.41%，无规卷曲所占百分比依次为26.92%，33.33%，33.07%，具体结构信息见图3-A。SWISS-MODEL预测的三级结构显示，结构组成主要以α-螺旋为主，与二级结构预测结果一致(图3-B)。DoIPTs蛋白三级结构残基模型为3a8t.1.A模型，DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b建模残基序列与IPT蛋白序列模型的同源性分别为52.30%(同源蛋白276 aa)，43.08%(同源蛋白261 aa)和44.49%(同源蛋白243 aa)。

A：蓝色.α-螺旋;红色.延伸链;绿色.β-转角;橘色.无规卷曲。A：Blue.α-helix;Red.Extended chain;Green.β-turn;Orange.Random curl.

对比DoIPT5a氨基酸序列与DcIPT3氨基酸序列(登录号为XM_039280767.1)得知，两者长度一致，但DoIPT5a在保守域前端少15个氨基酸残基，后端多15个氨基酸残基，两者后30个氨基酸残基差异较大；保守域中共15个氨基酸残基发生突变，包括Q60P、R70S、P83R、Y120A、A143V、A155D、S263C等。

2.3 DoIPTs氨基酸多序列比对和系统进化分析

应用ClustalX氨基酸比对发现(图4)，DoIPTs氨基酸序列N端有ATP/GTP结合位点P-loop NTPase结构域GXXGXGKS(T)(X代表任意氨基酸)。利用NCBI的BlastP程序以DoIPTs序列为目标序列搜索数据库中的同源序列，把同源序列与DoIPTs构建进化树(图5)得知，DoIPTs与其他物种IPTs序列具有较很高的相似性。首先山药DoIPT5s与单子叶植物凤梨 AcIPT5、深圳拟兰 AsIPT5、油棕EgIPT5、海枣PdIPT5、野生二粒小麦TdIPT5属于一大分支，亲缘关系最近；其次与拟南芥AtIPT2为旁系枝，相比拟南芥其余8个基因亲缘关系更近(图5)。

粉色显示同源级别为100%，蓝色同源级别为100%～75%，绿色高于75%～50%，白色低于33%；红色横线标识ATP/GTP结合位点GXXGXGK(X代表任意氨基酸)。Similarity of 100%，100%—75%，75%—50%，and 0—33% was displayed with pink，blue，green and white，respectively；The binding site GXXGXGK(X standed for any amino acid)of ATP/GTP was displayed with red horizontal line.

进化树枝叶由蛋白名及登录号代表，蛋白名前2个字母由物种拉丁名缩写得到。凤梨.AcIPT5；拟南芥.AtIPT(1—9)9个蛋白；深圳拟兰.AsIPT5；芜青.BrIPT3；油棕.EgIPT5；向日葵.HaIPT3；橡胶树.HbIPT3；木薯.MeIPT3；杨梅.MrIPT3；海枣.PdIPT5；可可.TcIPT3；野生二粒小麦.TdIPT5。本研究获得的蛋白用四菱形标出。

2.4 山药不同时间DoIPTs 基因表达分析

2.4.1 山药珠芽发芽时的基因表达分析 实时荧光定量PCR结果显示(图6)，珠芽采收后放置于22 ℃下，DoIPT1基因表达量在珠芽刚进入休眠和开始发芽2个时期，差异不显著(P>0.05)，2个时期都显著(P<0.05)高于半休眠时；DoIPT5a基因从珠芽刚进入休眠到发芽表达量升高，3个时期的表达量差异显著(P<0.05)；DoIPT5b基因表达量则在刚进入休眠最高，显著(P<0.05)高于后2个时期，后2个时期差异不显著(P>0.05)；在半休眠时和发芽时DoIPT5a基因表达高于DoIPT1和DoIPT5b基因(图6-A)。

图A为珠芽运用本体水分调节发芽时，珠芽表皮中基因的表达量；图B为珠芽采收60 d后，施加水后珠芽表皮中基因的表达量。图中不同小写字母表示差异显著(Duncan′s法，P<0.05)。图7同。

采收60 d后，在潮湿基质中催芽，每隔14 d测定基因表达量，发现在催芽的56 d内DOIPT1和DoIPT5b的表达量升高(图6-B)，第56天表达量显著高于其他时间段(P<0.05)；DoIPT5a基因的表达量则0～56 d呈现降-升-降-升的变化，最高表达量出现在第28天；在56 d内DOIPT1和DoIPT5b比DoIPT5a的表达量高。由此推测，在无水条件下DoIPT5a调控珠芽发芽，在潮湿环境中DoIPT1和DoIPT5b起主要调控作用。

2.4.2 山药珠芽多效唑处理后的基因表达分析 用不同浓度多效唑浸泡珠芽后，56 d内DoIPTs基因的表达结果见图7。0 mg/L的PP333处理珠芽第56天的DoIPT1基因表达量显著高于其他时间；5 mg/L PP333处理DoIPT1基因的表达量第28天显著高于其他时间(P<0.05)；25，45，65 mg/L的PP333处理后DoIPT1基因表达量最高值出现在第14天；85 mg/L PP333处理后第56天DoIPT1基因表达量最高；25，45 mg/L的PP333处理促进DoIPT5a基因在第14天开始高水平表达，且持续到第28天，65，85 mg/L的PP333处理后DoIPT5a基因表达分别是高值出现较早、持续时间短和表达量最高值出现较晚、持续时间长，而对照(0 mg/L的PP333处理)的DoIPT5a基因则在第56天才出现最高值；多效唑处理后，DoIPT5b基因的表达量在第14天或第28天出现最高值。总之，25～65 mg/L的多效唑处理后，DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b的最大表达量得到了提前。由此推测，多效唑处理能够提高DoIPTs基因的表达量。

图7 DoIPTs在不同浓度多效唑处理后的相对表达量Fig.7 Relative expression level of DoIPTs under different concentrations of PP333

3 讨论

本试验利用RT-PCR与RACE技术克隆DoIPTs基因，成功获得相应的3条mRNA全长。通过NCBI-Blast进行比对，与拟南芥等其他物种IPT基因相比较，相似度达70%。生物信息学分析也显示，DoIPTs蛋白属于P-loop-NTPase超级家族，含P-loop NTPase结构域(GXXGXGKS(T))，且与其他物种的保守结构域、蛋白结构[8]等均相似；这个基元序列(GXXGXGKS(或T))具有高度保守特征，能够结合细胞分裂素的合成底物，具有催化形成细胞分裂素的能力[9]。山药的IPT蛋白空间结构模型与各物种相似，如与黄瓜[10]、桃[11]及大豆[12]的IPT蛋白极其相似，由此推测，山药的3个IPT编码区可能具有催化合成细胞分裂素的生化功能。另外，NCBI-Blast比对发现，本研究得到的DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b核苷酸序列与冈比亚白山药基因组的3条序列(序列登录号分别是BDML01001166.1、BLBR01000012.1和BLBR01000019.1)的一致性分别为92.00%，96.00%和93.00%。所以，推测本研究得到了3条不同的IPT基因。

比对DoIPT5a核苷酸序列与冈比亚白山药相关基因(登录号为XM_039280767.1)得知，2条核苷酸序列同源性达96.09%；相应的2条氨基酸序列长度一致，但C-末端和N-末端差异较大，保守域中共15个氨基酸残基发生突变。在这2个薯蓣属植物氨基酸的保守域中，变异较大的位点是：Q60P，谷氨酸(酸性)与脯氨酸(碱性)的突变；R70S，精氨酸(碱性)与丝氨酸(中性)的突变；P83R，脯氨酸与精氨酸突变，电荷变化；Y120A，络氨酸与丙氨酸突变，DoIPT5a具有带苯环、结构更大的络氨酸；A143V，基团小的丙氨酸与基团大的缬氨酸突变；A155D，丙氨酸(中性)与天门冬氨酸(酸性)突变；S263C，半胱氨酸与丝氨酸的突变，DoIPT5a氨基酸序列中出现半胱氨酸，半胱氨酸影响氨基酸三级结构，是否形成四级结构有待研究。总之，IPT基因推导的氨基酸序列在薯蓣属物种间总体上保守，但保守域内已经发生基团大小、电荷、pH值及影响氨基酸结构的位点突变，这些突变是否直接影响细胞分裂素合成，以及由此造成何种生理影响有待进一步研究。

Oneto等[13]研究表明，缺水条件可诱导IPT基因表达及提高细胞分裂素水平，从而延长绿叶持久性，并维持光合速率和气孔导度正常，有助于提高缺水条件下C4植物的生产率。在缺水条件下，转基因植株的光合速率、气孔导度和蒸腾速率和产量均高于野生对照植株，其原因是IPT的表达可以延缓干旱诱导下叶片的衰老，提高转基因作物对干旱的耐受性[14-15]。植物IPT基因的表达对水存在敏感度，在水有限的地区IPT基因对植物具有开发性能，对作物产量的研究具有巨大的潜力。本研究发现，山药珠芽发芽时，IPT基因家族中不同成员的表达量因不同水分条件而异，DoIPT5a基因在无水处理时表达量最高，而在潮湿条件下却是DoIPT1和DoIPT5b相对表达量高，表明DoIPTs基因对水分胁迫产生应激表达。本研发现的表达模式为今后山药水分胁迫机理的研究提供参考。

在拟南芥中，AtIPT1、AtIPT2、AtIPT3、AtIPT8和AtIPT9不受生长素影响，但AtIPT5和AtIPT7受生长素诱导上调[16]。在芜菁(Brassicarapa)中，生长素抑制了BrIPT3-2、BrIPT5-2和BrIPT7-1的表达[17]。大豆GmIPT1基因受植物激素和化学试剂诱导上调[12]。在番茄(Solanumlycopersicum)果实中，ABA含量调节IPT4的表达，从而通过影响胡萝卜素异构酶基因ZISO的表达来积极调节番茄红素的生物合成[18]。海角旋果苣(Streptocarpusrexii)的SrTPT5和SrTPT92个基因中，萘乙酸(NAA)显著降低SrTPT5表达量，极显著降低SrIPT9表达量，6-苯甲氨基嘌呤(BAP)能降低2个基因的表达量，但没达到显著水平，赤霉酸(GA3)显著降低SrIPT9表达量，却不降低SrIPT5表达量[19]。以上研究表明，植物激素和化学试剂影响IPT基因的表达量。曾旭等[20]研究还表明，适当质量浓度的多效唑能够有效地提高小麦产量，促进半休眠的山药珠芽发芽[21]。本研究发现，多效唑使采收60 d后的山药珠芽中的DoIPTs基因上调，这能够解释贮藏60 d后山药珠芽的休眠解除启动才开始[22]，从而多效唑处理使珠芽发芽提早。另外，山药珠芽发芽前出现GA3含量下降，而多效唑处理加快GA3下降速度[23]，而GA3显著降低SrIPT9表达[19]，所以多效唑处理还可能通过降低GA3含量促进山药DoIPTs基因的表达量，进而促进珠芽发芽。多效唑究竟是直接使DoIPTs基因表达上调，还是通过降低GA3含量从而引起DoIPTs基因表达上调，还有待进一步研究。