基于网络药理学探讨大黄-水蛭-香附配伍治疗子宫内膜异位症的作用机制Δ

邓 颖，刘金坤，白殊同#(1.重庆市中医院妇科，重庆 40001； .重庆市中医院中医药防治自身免疫疾病重庆市重点实验室，重庆 40001)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMT)是一种发病机制尚未明确，以子宫内膜腺体或间质细胞出现在子宫腔或宫体肌层外为主要表现，且具有显著雌激素依赖性的慢性炎症性疾病[1]。EMT的发病率为10%～15%，是诱发慢性盆腔疼痛和不孕的主要病因之一，且该病具有显著的恶变倾向，给患者的身心健康造成严重危害[2]。EMT的治疗方法以药物治疗和手术治疗为主，虽然在临床中取得了良好的治疗效果，但仍存在部分患者疗效不佳和不良反应大的困扰[3]。因此，寻找新的EMT治疗药物具有极高的临床价值和广阔的市场前景。中医认为，EMT属于“经行腹痛”范畴，因情志或外感导致胞宫经血阻滞而不通则痛，或胞宫冲任濡养不足而不荣则痛所致[4-5]。我院妇科创始人张进主任中医师经过长期临床经验总结出“瘀血”为EMT的主要病机，并通过从瘀论治研制出长青胶囊，临床用于EMT的疗效显著。我院妇科夏敏主任结合自身长期治疗EMT的临床经验，在长青胶囊的基础上根据气行则血行的理论，加用香附，研制出大黄-水蛭-香附配伍方，该方功效为活血、祛瘀和止痛，临床研究结果表明该方能够降低EMT患者血清中CA125水平，缓解EMT引发的疼痛症状效果良好[6]。大黄-水蛭-香附配伍的作用机制至今仍未被阐述清楚，本研究采用网络药理学方法，通过构建大黄-水蛭-香附“化学成分-靶点-疾病靶标”之间的作用网络，分析各节点之间的相互作用，从而分析该方影响的潜在生物过程和信号通路，从“药物-靶点”网络分析大黄-水蛭-香附治疗EMT的作用机制，为基于该验方的中药新药开发提供参考。

1 资料与方法

1.1 大黄-水蛭-香附的化学成分和治疗靶点收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)，选择“Herb name”，检索大黄、香附和水蛭的成分和靶点信息。根据口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18作为筛选条件，获取大黄-水蛭-香附的潜在药效物质及其靶点信息。TCMSP系统未收录的中药信息，通过BATMAN-TCM数据库(http://bionet. ncpsb.org/batman-tcm/)补充检索水蛭活性成分和靶点信息，检索条件为“Score cutoff≥20，P-value cutoff < 0.05”。将上述2个数据库获得的活性成分和靶点信息整合，并通过Uniprot数据将靶蛋白名转换为标准基因名。

1.2 EMT疾病靶基因数据库的构建

以“Endometriosis”作为关键词在治疗靶点数据库(TTD)https://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中检索疾病靶蛋白信息，将GeneCards的检索条件设定为相关性评分≥2.00。合并上述数据库中获取的EMT靶点，并通过Uniport数据库将靶点名称转换为标准基因名，构建EMT疾病靶基因数据库。

1.3 成分-靶点-疾病网络构建

通过Venny 2.1.0在线软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，筛选大黄-水蛭-香附活性成分靶基因与EMT疾病基因的交集，作为大黄-水蛭-香附治疗EMT的核心靶点并绘制韦恩图[7]。使用Cytoscape 3.7.1软件将大黄-水蛭-香附化学成分和核心靶点进行网络可视化构建[8]。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析

通过STRING数据库(Version 11.0)(https://string-db.org/)，将98个核心靶蛋白信息上传至STRING数据库中进行检索，蛋白种属设置为“Homo sapiens”，以“minimum required interaction score>0.900”作为筛选条件，同时设置隐藏游离点，构建PPI网络[9]。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

通过R语言(3.6.1)中的Cluster Profiler数据包对98个靶点数据进行GO生物过程分析，结果展示排序前15位。通过DAVID(Vision 6.8)在线分析平台，对98个核心靶点进行KEGG通路富集分析，以P<0.01为筛选标准，下载数据保存文件，通过Excel软件对KEGG数据进行可视化，结果展示P值排序居前15位的信号通路。

2 结果

2.1 大黄-水蛭-香附活性成分筛选

通过TCMSP数据库获得大黄和香附的化学成分信息共196个，其中大黄92个，香附104个。在OB≥30%和DL≥0.18条件下，筛选出大黄活性成分10个，香附化学成分16个，共26个化学成分信息，其中β-谷甾醇(beta-sitosterol)为共有成分。通过BATMAN-TCM数据库获得水蛭活性成分15个，其中2个成分无靶点信息。合并上述数据，共获得38个化学成分和对应靶点信息。

2.2 EMT疾病靶点

通过TTD数据库检索到EMT疾病靶基因15个，GeneCards数据库相关性评分≥2.00分的EMT疾病靶点共423个。合并上述基因库靶基因并剔除重复项，共获得EMT疾病靶基因信息432个，通过Uniprot数据库将靶点转换为标准基因名，以此构建EMT疾病靶基因数据库。

2.3 大黄-水蛭-香附“成分-核心靶点-疾病”网络构建

大黄-水蛭-香附靶点数据库与EMT疾病靶点数据库合并结果显示，两数据库间的共同靶基因为98个(见图1)，提示其为大黄-水蛭-香附发挥治疗EMT作用的核心靶点。大黄-水蛭-香附的“活性成分-核心靶点-疾病”作用网络见图2，图中矩形节点代表活性成分，圆形节点代表靶点，边代表化合物-核心靶标-EMT之间的作用关系。该网络中共包含132个节点，342条边，度值排序居前5位的化学成分为槲皮素(quercetin，度值为64)、木犀草素(luteolin，度值为34)、山柰酚(kaempferol，度值为24)、番红花酸(crocetin，度值为21)和乌索酸(ursolic acid，度值为14)，度值排序居前5位的靶点为PTGS2(度值为21)、AR(度值为12)、PPARG(度值为10)、TOP2A(度值为9)和ESR1(度值为7)。

图1 大黄-水蛭-香附配伍与EMT靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of rhubarb-leech-incense compatibility and EMT targets

图2 大黄-水蛭-香附“成分-核心靶点-EMT”作用网络Fig 2 Network of “ingredient-core target-EMT” of rhubarb-leech-incense

2.4 大黄-水蛭-香附配伍治疗EMT关键靶点的PPI网络

通过STRING数据库对大黄-水蛭-香附活性治疗EMT的98个核心靶基因信息进行PPI分析，构建大黄-水蛭-香附治疗EMT核心靶基因的PPI网络，见图3。该网络包括98个节点，348条边，网络节点间平均度值为7.1。

图3 大黄-水蛭-香附配伍治疗EMT核心靶基因的PPI网络Fig 3 PPI network of core target gene of rhubarb-leech-incense in the treatment of EMT

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

(1)GO功能富集分析结果显示，大黄-水蛭-香附配伍的98个抗EMT核心基因共涉及2 300个生物过程，其中排序居前15位的生物过程为脂多糖反应、细菌来源分子的应答、活性氧簇反应、甾醇激素反应、腺体发育、细胞氧化应激反应、细胞对活性氧应答、上皮细胞增殖、肌肉细胞增殖及细胞对药物和营养的应答等多个生物过程，见表1、图4。提示大黄-水蛭-香附可通过参与上述多种生物过程实现抗EMT作用。(2)KEGG通路富集分析共富集到330条通路信息，排序居前15位的信号通路见图5，图中横坐标代表基因数量，纵坐标表示信号通路名称。大黄-水蛭-香附配伍潜在靶点富集后的通路主要为肿瘤信号通路(35个靶基因)、乙型肝炎信号通路(22个靶基因)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路(23个靶基因)、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路(15个靶基因)、缺氧诱导因子(HIF)信号通路(13个靶基因)、前列腺癌、类风湿关节炎和炎性肠病等信号通路。提示大黄-水蛭-香附的药效成分通过上述信号通路实现抗EMT的作用。

表1 大黄-水蛭-香附配伍的生物学功能信息Tab 1 Biological function information of rhubarb-leech-incense compatibility

P值代表富集的显著性，P值越小，其颜色越偏向深色，P值增大，图标颜色偏向浅色；横坐标表示富集的基因数目P-value represents the significance of enrichment, the smaller the P-value, the darker the color, and the higher the P-value, the lighter the color. The horizontal axis represents the number of enriched genes图4 大黄-水蛭-香附配伍抗EMT核心靶基因GO功能富集图Fig 4 GO functional enrichment diagram of rhubarb-leech-incense compatibility against EMT core target gene

图5 KEGG通路富集结果Fig 5 KEGG pathway analysis

3 讨论

EMT是一种临床常见的妇科疾病，患者常表现出痛经、腹腔包块等症状，甚至引起患者不孕。目前，西医治疗EMT仍存在一定的不足，无法获得满意的疗效[10]。大黄-水蛭-香附配伍是由我院妇科临床验方加工而成的协定处方，对EMT引起的月经痛、性交痛等具有良好的疗效。

本研究通过网络药理学方法对大黄-水蛭-香附配伍的药效物质和靶点进行筛选，最终获得38个活性成分和518个靶基因。通过分析活性成分靶点与EMT靶点的交集，构建“活性成分-靶点-EMT”作用网络，在该核心网络中槲皮素、木犀草素、山柰酚、番红花酸和乌索酸的自由度值最高，能够与14个以上的EMT靶点发生相互作用。槲皮素、山柰酚和木犀草素具有调节脂代谢异常、抗炎、免疫调节和抗氧化，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等多种功效[11]。槲皮素在实验研究中表现出显著的抗EMT作用[12]。提示上述5种活性成分与EMT的多个疾病靶点具有亲和活性，是大黄-水蛭-香附发挥多靶点协同作用的关键物质。PTGS2、AR、PPARG、TOP2A和ESR1是网络中自由度最高的5个靶点，能够与多个大黄-水蛭-香附成分靶点发生结合，而PTGS2、 PPARG和TOP2A具有调节细胞的增殖、迁移、炎症、缺氧环境应答、脂质代谢和肿瘤发生等多种生物学功能，其中PTGS2在卵丘细胞中的低表达与EMT患者不孕相关[13]；ESR1和AR表达异常也与EMT的发生关系密切[14-15]。提示上述靶点是大黄-水蛭-香附发挥功效的关键靶点。

对核心靶基因的GO分析结果显示，大黄-水蛭-香附主要参与脂多糖应答、甾体激素应答、抗氧化、抑制细胞氧化应激反应和抗肿瘤等多个生物过程，上述生物过程均与EMT的发生和发展相关，对上述生物过程的干预作用可能是该方发挥药效的关键。KEGG分析结果显示，大黄-水蛭-香附主要影响肿瘤信号通路、乙型肝炎、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路和TNF信号通路，上述通路与EMT的细胞增殖、侵袭、转移和血管新生等生物过程相关[16]。PI3K/Akt信号通路对子宫内膜异位发生和发展过程中的细胞增殖、侵袭、转移和血管新生过程具有调控作用[17]。HIF信号通路是细胞和组织响应外部缺氧环境应答的主要调节通路，在该信号通路激活条件下，EMT模型大鼠的异位内膜组织体积增大，新生血管数量增多[18]。

综上所述，本研究通过网络药理学方法对大黄-水蛭-香附治疗EMT的药效物质和作用机制进行了初步探讨，分析了大黄-水蛭-香附抗EMT的药效物质和作用靶基因网络，以及其中涉及的主要生物过程和潜在调控作用信号通路，为进一步分析其作用机制提供了新线索。