酒制补骨脂炮制工艺优化

陈李东,张学顺,刘晓倩

(山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)

补骨脂别名破故纸，是豆科草本植物补骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果实，性温、味辛，归肾、脾经。具有补肾固精、缩尿止带、温脾止泻、固冲安胎之功效[1-2]。临床上有广泛应用，内服主治肾虚冷泻、阳痿遗精、遗尿尿频、腰膝冷痛等；外用主治皮肤病、白癜风[3-4]等。近年来国内外研究表明，补骨脂还具有抗菌、抗肿瘤、抗骨质疏松等作用[5]。

据《雷公炮炙论》记载补骨脂“性本大燥，毒”[6]，其久服有毒副作用，入药前需经过炮制[7]，以使其毒性明显降低。补骨脂炮制方法较多，课题组前期的试验研究选取了具有代表性的15种炮制方法，采用高效液相法确定了酒焙法为补骨脂的最佳炮制方法。酒焙法的炮制工艺条件文献记载较少，缺乏客观的量化标准，易造成炮制品的质量标准可能存在不规范性的问题。鉴于此，本试验以补骨脂中的有效成分(补骨脂素、异补骨脂素[8])和有毒成分(补骨脂酚，具有肝肾毒性且具有较高细胞毒性[9-10])为考察因素，采用正交优选试验[11]来优化酒焙法炮制工艺条件，为补骨脂的炮制工艺规范化提供试验数据。

1 试验材料

1.1 仪器 安捷伦1260分析型高效液相色谱仪；超声波提取器(昆山市超声仪器公司)；AB135-S型电子天平。

1.2 试药 补骨脂药材(购于安国市任德兴药材有限公司，批号：1804002)；乙腈为色谱乙腈；甲醇为分析纯；水(娃哈哈纯净水)；绍兴黄酒(浙江塔牌公司)；补骨脂素对照品(购于上海源叶公司，批号:YJ07315A14)；异补骨脂素对照品(购于上海源叶公司，批号:R01A6F1)；补骨脂酚对照品(购于上海源叶公司，批号:YM0316SB13)。

2 方法与结果

2.1 酒制补骨脂的制备 取补骨脂9份，每份100 g，按照正交试验设计加炮制用黄酒闷润36 h，随后置于烘箱中烘制。选择药酒比例(A)、烘制时间(B)、和烘制温度(C)3 个因素，每个因素取3 个水平，采用L9(34)正交表安排试验(因素水平见表1)。考虑到试验中可能存在误差的影响，每次试验平行3次。

表1 正交因素水平表

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱，程序为：0～8 min，20% A→40% A；8～18 min，40% A→70% A；18～21 min，70% A→85% A；21～30 min，85% A；30～32 min，20% A；流速0.8 mL·min-1；检测波长250 nm；柱温35 ℃；进样量5 μL。

2.2.2 对照品溶液制备 分别精密称取3种对照品0.82、0.78、1.96 mg，甲醇溶解并定容于50 mL棕色量瓶，制得混合对照品溶液，补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚对照品浓度分别为16.4、15.6、39.2 μg·mL-1。

2.2.3 供试品溶液制备 取样品，粉碎，过60目筛，精密称取各粉末1.0 g，置于索氏提取器中，加甲醇适量，加热回流，提取2 h，冷却，转移到250 mL量瓶，加甲醇适量稀释到刻度，混匀，过0.45 μm微孔滤膜，取滤液，备用。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察 采用“2.2.1”项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液2、5、8、12、18、30 μL，注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，记录峰面积，以峰面积值(Y)和进样量(X)进行线性回归分析，结果补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚的回归方程分别是Y=6 569.1X-3.835 7(R2=0.999 9)、Y=7 712X-4.332 4(R2=1)、Y=18 884X+3.205 3(R2=1)，进样量范围分别在0.033～0.492 μg、0.031～0.468 μg、0.078～1.176 μg线性关系良好。

2.2.4.2 精密度试验 采用“2.2.1”项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液5 μL，重复进样6次，记录混合对照品中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚峰面积的精密度RSD分别为0.80%、0.75%、0.31%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.3 稳定性试验 采用“2.2.1”项下色谱条件，取“2.2.3”项下各供试品溶液5 μL，分别于24 h内6次测定含量，各共有峰的相对保留时间的RSD均小于1.6%，相对峰面积的RSD均小于2.12%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.4.4 重复性试验 采用“2.2.1”项下色谱条件，取“2.2.3”项下供试品溶液平行试验5次记录样品的HPLC色图谱，共有峰的相对峰面积的RSD均小于1.93%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.5 加样回收率试验 精密称定含有量已知的药材粉末6份，每份约0.5 g，精密加入各对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项下色谱条件下进样测定6次，测得各成分加样回收率分别在99.34%～102.17%，RSD为0.67%～0.83%，表明该方法稳定可行。

2.2.5 样品测定 取“2.1”项下各炮制品，粉碎，过60目筛，照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.2.1”项下的色谱条件测定，精密吸取供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪分析测定。

2.3 正交试验优选 采用综合评分法对指标性成分进行评价，将各指标的最大值作为参照标准，对同一指标中数据进行了标准化处理，处理公式：Dab=Xab/(Xb)max×100。其中Xab表示第a次试验中第b个指标的测定值，Dab表示第b个指标的第a个测定值的标准化数据，a的取值范围为1至9；b的取值范围为1、2、3，设定评价总分为100分，对各炮制品的补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚依次打分评价。补骨脂素和异补骨脂素的Dab值设定为正值，补骨脂酚Dab值设为负值，综合评分Y值是三者评分之和。试验安排及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验表及综合评分结果

表3 方差分析表

由直观分析可知，各因素对酒焙法炮制工艺的影响顺序为A>B>C，方差分析表明因素A、B、C都对综合评价总分Y值具有显著性的影响，其中A因素影响最大。最佳炮制工艺条件定为A2B2C3，即每100 g补骨脂药材，加15%的黄酒，烘制温度140 ℃，烘制时间120 min。

2.4 验证试验 精密称取补骨脂药材3份，按最佳炮制工艺进行3次重复试验。结果测得3份炮制品有效成分含量均高于生品，毒性成分含量均低于生品，平行实验获得的样品的指标性成分含量基本没有差异，结果表明优选的炮制工艺有很好的重现性，合理可行，测定结果见表4。

表4 含量测定结果

3 讨论

补骨脂为传统中药，临床应用广泛。近年来，有关补骨脂临床不良反应报道越来越多[12-15]，补骨脂的用药安全问题亟待解决。补骨脂临床多以炮制品入药，本课题组前期研究结果显示，酒焙法炮制补骨脂优胜于其他炮制法。为进一步探讨酒焙法的炮制工艺，本试验通过正交试验设计，根据加酒量、烘干温度和烘干时间炮制出9份不同条件下的补骨脂的样品。应用高效液相色谱法进行指标性成分含量情况的测定得到酒焙法炮制工艺的影响顺序是药酒比例>烘制时间>烘制温度。确定了酒制补骨脂的最佳炮制工艺是补骨脂药材100 g，加15%黄酒，烘制时间120 min，烘制温度140 ℃。

单因素考察预试验结果提示黄酒的用量对补骨脂中指标性成分有一定的影响，开始随药酒比例的增加而上升，当药酒比例达15%时，此时有效成分的含量最高，宋潇等[16]报道，酒制补骨脂可在炮制过程中发生补骨脂苷和异补骨脂苷向补骨脂素和异补骨脂素的转化，可能因此引起有效成分的增加。但随着药酒比例的增大，二者的含量却逐渐降低，推测闷润过程中，大量的黄酒起到了提取溶媒的作用，导致指标性成分溶于黄酒[17]，造成指标性成分含量的损失。补骨脂酚的含量随酒药比例的增加而降低，其中药酒比例从5%到15%时补骨脂酚含量降低的幅度最大。虽然提高酒药比例，可以降低补骨脂酚的含量，但对有效成分的损失较大。

在烘制过程中，烘制时间的长短和烘制温度的高低对补骨脂成分的变化也有一定影响。推测烘制激活了药材中某些酶的活性，在一定烘制时间和温度范围内，使得补骨脂苷和异补骨脂苷向补骨脂素和异补骨脂素的转化增加，引起有效成分的增加，同时因补骨脂酚具有挥发性[18]，随着烘制的温度升高及时间的延长，该成分含量也随之下降。

本试验分别比较了绍兴黄酒、即墨黄酒、白酒及95%乙醇4种辅料对补骨脂药材中指标性成分的影响。通过试验探究发现绍兴黄酒和即墨黄酒制备的炮制品中补骨脂素和异补骨脂素的含量明显高于白酒和乙醇，4种炮制辅料对补骨脂酚影响不太明显，在绍兴黄酒炮制品中补骨脂酚成分略低于其他3种炮制品，综合考虑辅料对补骨脂中有效和有毒成分的影响，因此本试验采用绍兴黄酒作为本试验炮制辅料用酒。

今后，本试验将考察补骨脂生品及不同炮制品对氢化可的松造肾阳虚小鼠的治疗作用，用于明确药材炮制前后的药效学变化，为其量效关系研究奠定基础。