基于网络药理学及分子对接探讨“柴胡-当归”药对治疗乳腺增生的作用机制

袁名扬，周学刚，扈丹丹，蒋蕾，杨波*，彭海生*

(1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.哈尔滨医科大学大庆校区药学院，黑龙江 大庆 163319)

乳腺增生病(mammary gland hyperplasia，MGH)，也称乳腺增生症，是一种非炎性非肿瘤性疾病，是最常见的乳腺疾病[1]。乳腺增生好发于中年女性[2]，常表现为乳房肿块疼痛和乳腺摸到结节，近些年发病率有越来越低龄化的趋势。乳腺增生发病因素错综复杂，在中医属于“乳癖”范畴，与肝气郁结、气血瘀滞密切相关。现代医学则认为，乳腺增生的主要病因是下丘脑-垂体-卵巢轴内分泌功能失调引起的。由于疼痛反复和治疗周期漫长，乳腺增生已经严重的影响患者的身心健康，甚至影响到工作和生活。

西医对于乳腺增生的治疗主要采用内分泌药物治疗或手术治疗方案，但效果不理想，且有副作用[3]。通过目前临床研究，治疗乳腺增生常用中医疗法，且中医疗法具有疗效好、毒副作用小、患者易于接受等优点[4]。逍遥散(柴胡、当归、白芍、茯苓、白术、甘草)是乳腺增生治疗应用最广泛的中医方剂，很多治疗乳腺增生的方剂以其作为基础方加减而成。其中柴胡作为其君药，同时也是治疗乳腺增生用药中出现频次最多、比例最大的单味药，具有行气疏肝的作用；当归作为臣药，具有养血柔肝的功效。柴胡、当归在中药治疗乳腺增生的用药的组合使用频次较高[5]，二者联用，可疏肝解郁，使肝条达、疏泄，以达舒肝散郁，祛邪而不伤正之效。然而，目前对“柴胡-当归”药对治疗乳腺增生的活性成分研究较少，作用机制尚不明确。

本研究基于网络药理学，构建“药对-活性成分-靶点-疾病”等网络，获得药物作用于乳腺增生的潜在作用靶点，并在GO数据库和KEGG数据库进行富集分析，预测其关键通路，深入探讨药对与疾病的关系，揭示“柴胡-当归”药对治疗乳腺增生的潜在作用机制，为临床治疗乳腺增生提供新思路，同时也为进一步临床试验和基础研究奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 “柴胡-当归”药对活性成分及靶点蛋白的筛选 将“柴胡”和“当归”作为关键词，利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https://tcmsp-e.com)，分别搜索其主要化学成分；筛选口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18[6-7]的活性化合物，获得活性成分，并提取活性成分对应的蛋白质靶点。OB是口服药物进入系统循环转运有效性评价的重要指标，OB数值越高代表药物生物活性分子的DL越好[8]。通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，将获得的靶点进行标准化。

1.2 乳腺增生相关靶点的筛选 在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)以 “Mammary gland hyperplasia” OR “MGH” 为关键词检索与乳腺增生疾病相关的靶点基因。

1.3 药对-活性成分-作用靶点-疾病网络的构建 利用Venn在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)获得“柴胡-当归”药对活性成分与乳腺增生的交集靶点，作为潜在作用靶点。将潜在作用靶点通过Cyto-scape 3.6.0软件构建药对-活性成分-作用靶点-疾病网络图。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络的构建 将交集基因导入STRING数据库(https://string-db.org)，将蛋白种类设定为“Homo snpiens”，根据相互作用最佳可视化分析，设置最小相互作用阈值设定为 “Highest confidence> 0.7”，去除游离蛋白质，其余设置均为默认，构建PPI网络图，下载csv格式文件，通过Cytoscape 3.6.0软件进行调整。

1.5 分子对接分析活性成分与靶蛋白的结合作用 基于“1.4”项下所述PPI网络，筛选度值排名前5位的靶标，从RCSB PDB数据库(http://www1.rcsb.org/)下载其对应蛋白，保存为pdb文件。在TCMSP中下载“柴胡-当归”药对主要活性成分的结构，并保存成mol2文件。然后采用Mgltools 1.5.6软件，去水加全氢，分离配体与受体，并保存为pdbqt文件。通过Autodock Vina 1.1.2将配体与受体进行对接，通过对接结果分析“柴胡-当归”药对活性成分与核心靶标之间的结合活性。若结合能 ≤-5.0 kcal·mol-1，则表明配体与受体之间可以结合；若结合能 ≤-7.0 kcal·mol-1，则表明配体与受体之间具有较好的亲和力[9]。分析结果后，取核心靶标与活性成分结合活性打分最高的构象用PyMol软件进行分析作图。

1.6 交集基因的富集分析 借用RStudio软件对交集基因进行GO分析和KEGG通路富集分析。筛选P<0.05[10]的生物学过程与通路，再选取靶标富集数量最多的前10条生物学过程与前30条通路，综合相关研究文献筛选出可能与治疗乳腺增生相关的通路，作为该药对治疗乳腺增生的关键通路。

1.7 活性成分-关键靶点-关键通路网络的构建 通过Cytoscape3.6.0构建活性成分-关键靶点-关键通路等多层次网络图，利用其中的Network Analyzer插件对自由度(Degree)等相关参数对网络图进行分析。

2 结果

2.1 “柴胡-当归”药对活性成分筛选结果 通过TCMSP数据库检索共获得柴胡活性成分17种、当归活性成分2种，合并去重后共获得活性成分18种，豆甾醇为二者共同成分，详见表1。

表1 “柴胡-当归”药对活性成分信息

2.2 乳腺增生相关靶点检索结果 共获得乳腺增生相关靶点4 371个。

2.3 药对-活性成分-作用靶点-疾病网络的分析结果 通过Draw Venn Diagram在线工具绘制韦恩图(见图1)共获得“柴胡-当归”药对活性成分靶点与乳腺增生靶点的交集基因150个。将上述交集基因导入Cytoscape 3.6.0软件中，构建药对-活性成分-作用靶点-疾病网络图(见图2)。从该网络图中可以看出，该网络含节点共163个(1个疾病节点、2个药材节点、10个活性成分节点、150个靶点节点)，317条边。其中疾病用黄色表示，“柴胡-当归”药对用绿色表示，活性成分用粉色表示，潜在作用靶点用蓝色表示。

图1 “柴胡-当归”药对活性成分与MGH交集基因的韦恩图

图2 药对-活性成分-作用靶点-疾病网络图

2.4 “柴胡-当归”药对活性成分与乳腺增生交集基因PPI网络 PPI网络图见图3。该网络含150个节点与1 167条边。“柴胡-当归”药对可能通过白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤蛋白p53(TP53)、蛋白激酶(AKT1)及血管内皮生长因子A(VEGFA)等关键靶点发挥治疗乳腺增生的作用。

图3 “柴胡-当归”药对靶蛋白PPI网络

2.5 活性成分与核心靶点分子对接结果 通过靶标相互作用网络中度值排名前五的关键靶标AKT1、TNF、TP53、VEGFA、IL-6，将其与“柴胡-当归”药对的18个活性成分做分子对接验证，统计活性成分数目，结果见表2。结果显示，AKT1与15个活性成分结合亲和性为较强或很强，TNF有17个、TP53有11个、VEGFA有13个、IL-6有11个，由此可见“柴胡-当归”药对的活性成分与核心靶标具有较强的结合能力。核心靶标与活性成分结合活性打分最高的构象用PyMol软件进行分析后，见图4。

表2 活性成分与核心靶点分子对接结果

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析 通过RStudio软件对交集基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，得到GO条目2 432个(P<0.05)，生物过程(BP)2 233个、细胞组成(CC)39个、分子功能(MF)160个，根据富集靶标数量由多到少进行排序，其中富集基因数排序前10位的GO分析结果见表3～5。KEGG根据P<0.05筛选得到170条通路，通路富集分析结果(前30位)见图5。

a.AKT1与豆甾醇；b.TNF与α-菠菜甾醇；c.TP53与α-菠菜甾醇；d.VEGFA与豆甾醇；e.IL-6与豆甾醇图4 活性成分与核心靶点分子对接结果图

表3 GO富集分析-分子功能

表4 GO富集分析-细胞组成

表5 GO富集分析-生物过程

图5 “柴胡-当归”药对治疗MGH的KEGG通路

经GO和KEGG通路富集分析发现，“柴胡-当归”药对治疗MGH的分子功能主要包括细胞因子受体结合、转录辅因子结合等；生物过程主要包括活性氧代谢、氧化应激反应等；细胞组分主要包括膜区、细胞质膜筏等；信号通路主要涉及IL-17信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路等。

2.7 活性成分-关键靶点-关键通路网络构建 综合阅读文献与KEGG分析结果，选出可能与MGH相关的通路，构建活性成分-关键靶点-关键通路网络图，详见图6。其中三角形代表关键通路，箭头形状代表关键靶标，六边形代表活性成分。

图6 活性成分-关键靶标-关键通路网络

由图6可见，“柴胡-当归”药对治疗乳腺增生是由多个活性成分、多个靶标及多个通路共同作用的过程。其中，与关键通路有关的活性成分有矮牵牛素、山柰酚、槲皮素、3,3″,4″,5,5″,6,7-六甲氧基黄酮等；关键靶标有IL-1、EGF、E2F、CCL2、IL-6等；通路主要涉及内分泌耐药、MAPK信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等。

3 讨论

本研究通过“活性成分-关键靶点-关键通路”网络的构建，获得与乳腺增生有关的活性成分为槲皮素、山柰酚、矮牵牛素及3,3″,4″,5,5″,6,7-六甲氧基黄酮等。其中槲皮素、山柰酚及3,3″,4″,5,5″,6,7-六甲氧基黄酮均为黄酮类成分，黄酮类化合物具有保护肝脏的效能，还具有类雌激素或抗雌激素作用[11]。雌激素在乳腺增生发展中起到重要的作用，可以通过影响生长因子的合成来促进乳腺细胞增殖，而黄酮类化合物可通过调节雌激素代谢基因的表达，减少雌激素代谢物的产生，如槲皮素可以发挥抗雌激素效应，高浓度时能抑制乳腺上皮细胞存活[12]，从而起到治疗乳腺增生的作用。

PPI拓扑学分析结果显示，AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF等靶点度值较大，是“柴胡-当归”药对治疗乳腺增生潜在核心靶点。AKT1是一种参与细胞存活和细胞周期调控的靶点，乳腺增生的延迟退化与在AKT1中的Thr308位点磷酸化增加有关。数据表明，AKT1还参与调控哺乳期乳腺细胞的生长[13]。TP53位点处于p53基因的内含子中，有稳定基因组、调节转录、抑制细胞周期进展、促进凋亡等作用。P53可以通过蛋白降解调控Spy1蛋白的表达，p53的突变或消失会使Spy1水平提高，从而导致乳腺增生[14]。细胞生长增殖需要从血管中获得营养，乳腺组织增生过度也需新血管生成来供应营养。VEGFA与其受体通过旁分泌途径协同调节内皮细胞分化和血管生成，刺激血管生成促进肿瘤细胞的生长和转移，VEGFA的表达随着增生程度的加重而增加[15]。“柴胡-当归”药对可以降低VEGFA的表达，抑制乳腺增生组织新生血管形成，从而治疗乳腺增生。炎性因子TNF可以通过降低氧化应激反应相关蛋白8-OHdG和NT的表达，来缓解乳腺增生炎症和氧化应激反应，“柴胡-当归”药对可能是通过调节TNF的表达，增强免疫功能，从而起到缓解乳腺增生的作用[16]。

综合GO和KEGG分析以及既往研究发现，“柴胡-当归”药对可能通过IL-7信号通路、TNF信号通路、内分泌耐药、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等实现对乳腺增生的治疗作用。KEGG通路图显示，IL-17信号通路通过NF-κB信号通路、MAPK信号通路调控乳腺增生的治疗。IL-17信号通路可以激活NF-κB或者增加IL-6的分泌，发挥其促炎症作用，使COX-2表达增加，引起组织增生[17]。同时，IL-1β、IL-6、IFN-γ与TNF-α等在MAPK信号通路中通过协同作用在自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用，可以增强免疫力，起到缓解乳腺增生的效能。TNF信号通路可以通过巨噬细胞分泌的TNF-α影响VEGF的表达，影响乳腺组织新血管的生成，但表达途径尚不明确；也可能通过泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白水解过程，激活转录因子AP-1或者IKβ激酶，激活NF-κB的活性，诱导负性凋亡调节因子，从而促进乳腺组织细胞的增殖。HER2是介导乳腺增生内分泌耐药的一个重要的生长因子受体，生长因子受体与ER信号通路彼此串话，双向调节，可以共同刺激乳腺细胞[18]。KEGG分析结果表明PI3K-Akt信号通路与内分泌耐药有关，有研究证明，通过抑制PI3K或AKT的活性可以增强ER表达，影响内分泌耐药效果，从而治疗乳腺增生[19]。MAPK信号通路可能通过参与内分泌调节、炎症反应和氧化应激反应来起到治疗乳腺增生的效用[20]，主要包括ERK1/2、JNK、P38和ERK5四条通路。MAPK信号通路被证实可以调节雌激素和黄体酮的受体ER和PR[21]，影响乳腺细胞的增殖。ER和HER-2信号通路相互作用，也会激活MAPK信号通路，诱导ER磷酸化，促进乳腺细胞增殖[22]。HIF-1信号通路是一种缺氧适应性信号通路，参与调节细胞凋亡、细胞周期等过程，还可以调控免疫反应、新血管的生成等，增加组织的缺氧耐受力。主要靶点为HIF-1α，低氧时HIF-1α的稳定性会增加。HIF-1通路和其他信号通路的交叉调节对乳腺增生的治疗起到很好地效能。缺氧时，细胞内ERK发生磷酸化，促进HIF-1的表达，因而可以推断MAPK信号通路可以调控HIF-1的表达从而共同治疗乳腺增生，但其机制仍需要进一步研究[23]。此外，HIF-1信号通路还与NF-κB介导的炎症信号通路有一定的相关性，炎症刺激因子可以通过调控NF-κB介导的炎症信号通路来增加HIF-1基因和蛋白水平的表达，调节炎症反应，从而发挥抗乳腺增生的效能[24]。

综上所述，“柴胡-当归”药对可能通过调节AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF等核心靶点，参与IL-7信号通路、TNF信号通路、内分泌耐药、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等途径，从而调控细胞的氧化应激反应、炎症反应、抗新血管生成、细胞增殖和凋亡等过程，起到治疗乳腺增生的作用。本研究所得结论大部分与现有研究报道相符合，进一步地证明了网络药理学与中药研究的结合，可以挖掘中医药治疗疾病的作用机制，同时也为中药研发提供理论支撑。然而，本研究结果只是对“柴胡-当归”药对治疗乳腺增生作用机制的预测，仅仅停留在生物信息分析层面，具体靶点和通路间的作用机制还需要进一步的实验去验证，从而为乳腺增生治疗药物的研发提供方向和依据。