阿胶糕中驴皮源成分的质量控制研究

赵艳霞，姜树银，巩丽萍，石峰*，程春雷，罗学刚

(1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

阿胶糕属于药食同源产品，采用阿胶配以黑芝麻、核桃仁、冰糖、黄酒等制作出而成，具有补血养气、美容养颜、润肠通便、提高免疫力的综合保健功效，是老少皆宜的具有复合保健价值的产品。阿胶[1]作为主要原材料起主要作用，具有生血作用，可用于失血贫血、缺铁贫血，并对儿童、青少年的生长发育具有改善作用，因此阿胶的品质也决定了阿胶糕产品的品质。

阿胶糕作为阿胶的衍生品，极具山东地方特色，目前山东省获得生产许可的企业有129家，占全国90%以上，市场占有量大，主要分布在聊城、济南等地市。但是近年来的产品检查中发现市场上存在大量的以次充好，以假乱真的现象，产品质量参差不齐，给地方特色产品带来了不良影响。因此亟需制定检测标准，控制产品质量，打击掺伪掺假现象。

目前对于阿胶糕的皮源成分控制尚未有国家标准、地方标准发布，现有检测方法多为脂肪、氨基酸等的测定，在查阅文献及本实验室阿胶相关研究[2-8]的基础上，建立了阿胶糕中驴皮源成分的检测方法，方法简便、快速、准确、可有效控制产品质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AB SCIEX 5500超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪； XSE205电子天平；高速万能粉碎机；恒温数控超声仪；Vortex-6涡旋振荡器；Millipore超纯水机。

1.2 试剂试药 乙腈、甲酸为色谱纯；丙酮、三氯乙酸、碳酸氢铵及胰蛋白酶均为分析纯，水为去离子水。对照品：驴源多肽A2(C51H82N18O18)，含量≥94.2%，购于中国食品药品检定研究院；驴源多肽A2同位素内标(C51H82N16O18-15N2)，含量：94.6%，由上海强耀生物有限公司合成。阿胶糕样品来源于市场及不同厂家共21批次。

2 试验方法

2.1 色谱、质谱条件 液相条件：色谱柱为Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，2.5 μm)，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序：0～1.5 min，5%B；1.5～6 min，5%B→50%B；6～6.1 min，50%B→70%B；6.1～8 min，70%B；8～8.1 min，70%B→5%B；8.1～12 min，5%B。流速0.3 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量2 μL。

液相色谱条件：色谱柱为Waters XBridge BEH C18(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)。流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序：0～1 min，10%B；1～5 min，10%B→50%B；5～5.1 min，50%B→70%B；5.1～7 min，70%B；7～7.1 min，70%B→10%B；7.1～10 min，10%B。流速为0.3 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量2 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)正离子扫描模式，多反应监测；离子源温度：550 ℃；离子化电压：5 500；气帘气：35；雾化气：50；辅助加热气：55；定性、定量离子对、锥孔电压、碰撞能量见表1。

表1 化合物的质谱采集离子信息

2.2 溶液配制

2.2.1 驴源多肽A2标准储备液、内标储备液 分别取驴源多肽A2标准品、驴源多肽A2同位素内标约10 mg，精密称定，分别置10 mL容量瓶，用1%碳酸氢铵溶液溶解并定容至刻度，摇匀。

2.2.2 标准工作溶液 精密量取驴源多肽A2标准储备液200 μL于10 mL容量瓶，用1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，临用现配。

2.2.3 内标工作溶液 精密量取驴源多肽A2同位素标准储备液100 μL于10 mL容量瓶，用1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，临用现配。

2.2.4 标准曲线制备 精密量取标准工作溶液适量，分别加入一定量内标工作溶液，用1%碳酸氢铵溶液稀释，配制成浓度为20、50、100、250、500 ng·mL-1的系列标准溶液(内标浓度为200 ng·mL-1)，供液相色谱-串联质谱测定。

2.3 样品前处理 取样品约50 g，冷冻放置过夜，取出，置于粉碎机中粉碎。称取粉碎好的样品1.0 g，置于50 mL塑料离心管中，精密加入1%碳酸氢铵溶液50 mL，超声处理30 min，于4 ℃ 8 000 r·min-1离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，精密量取上清液1 mL，于15 mL塑料离心管中，加胰蛋白酶溶液(1 mg·mL-1)1.0 mL，再加入内标工作溶液100 μL，用1%碳酸氢铵溶液稀释至5 mL，摇匀，置于恒温箱中，于37 ℃恒温酶解16 h，取出，冷却至室温，供液相色谱-串联质谱测定。

3 结果与讨论

3.1 定性测定 在同样测试条件下，样品溶液中驴源多肽A2的保留时间与标准工作液中驴源多肽A2的保留时间之比，偏差在±5%以内，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的标准溶液相对丰度一致。

3.2 驴皮源成分指标的选择 目前《中国药典》收载的用于阿胶鉴别的驴皮源成分为驴源多肽A1和驴源多肽A2，在研究中发现，这两个特征性多肽在阿胶中检出稳定，但是在阿胶糕的检测中发现驴源多肽A1结果不稳定，不适合作为指标性成分，因此只选择了检出稳定的驴源多肽A2作为阿胶糕中驴皮源成分的检测指标，适用性更好。

3.3 色谱条件的考察 本研究比较了不同色谱柱及0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液两种流动相体系对目标化合物进行分离的情况。结果表明不同色谱柱上驴源多肽A2的保留差异不大，样品溶液经酶解后有一定的基质，填料粒径越小的色谱柱压力越大，推荐使用填料粒径相对大的色谱柱为分析色谱柱。流动相中酸的加入可使氢离子的浓度在梯度洗脱过程中保持稳定，选择0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液作为最终的流动相。驴源多肽A2及其同位素内标溶液(50 mg·L-1)的MRM色谱图见图1。

图1 驴源多肽A2及其同位素内标溶液的MRM色谱图

3.4 质谱参数的优化 将驴源多肽A2标准溶液(1 μg·mL-1)通过蠕动泵进样，通过一级全扫描找到驴源多肽A1、驴源多肽A2的母离子，再分别以一级母离子通过二级全扫描找到二级碎片离子，并通过不断改变碰撞能使碎片离子响应增强，通过优化获得最佳离子源参数，确定碎裂电压及碰撞能量。

3.5 酶解条件的优化 结合前期的研究[3-5]，样品水解采用胰蛋白酶，酶解温度37 ℃，酶解时间16 h。本研究主要对酶的用量进行了考察，取同一浓度样品，分别加入不同量的胰蛋白酶，酶解后进样分析，结果见图2。

图2 样品在不同酶用量下的结果

由图2可以看出，酶的用量超过1.0 mL以后，结果趋于稳定，样品完全酶解，综合考虑，本方法选择酶的用量为1.0 mL。

3.6 样品前处理的考察 取样品样品滤液分别进行以下两种处理方式。

3.6.1 样品滤液直接酶解处理 精密量取样品滤液1.00 mL，加胰蛋白酶溶液1.0 mL，用1%碳酸氢铵溶液稀释至5 mL，摇匀，置于恒温箱中，于37 ℃恒温酶解16 h，取出，冷却至室温，经0.22 μm滤膜过滤，进样测定。

3.6.2 样品滤液经30%三氯乙酸沉淀蛋白 精密量取样品滤液4.0 mL，加入4 mL的30%三氯乙酸溶液，充分振荡混匀，4 ℃静置20 min，于8 000 r·min-1离心5 min，弃上清，用2 mL冷丙酮洗涤沉淀，于8 000 r·min-1离心5 min，弃丙酮清液；重复洗涤一次，得沉淀，室温下置通风橱10 min挥干丙酮，制得阿胶蛋白提取物。向阿胶蛋白提取物中加1%碳酸氢铵溶液10 mL，超声使溶解，加1%碳酸氢铵溶液稀释至15 mL。再精密量取1.00 mL，加胰蛋白酶溶液1.0 mL，用1%碳酸氢铵溶液稀释至5 mL，摇匀，置于恒温箱中，于37 ℃恒温酶解16 h，取出，冷却至室温，经0.22 μm滤膜过滤，进样测定。

按照上述两种样品前处理方法考察了不同厂家的样品，同时阿胶对照药材也按照同法处理，结果见表2。

表2 样品经不同前处理方法的测定结果

由表2可以看出，样品直接溶解稀释后酶解测定方法更简便、准确度更高，所以样品制备采用直接溶解稀释法处理。

3.7 定量方式的确定与基质效应评价 采用液质联用法进行基质复杂样品分析，其复杂基质可能会对测定结果产生影响，因此，在方法建立时需对基质效应进行评价[9]。在实验中对样品进行不同倍数的稀释后进样测定，结果发现随着稀释倍数增大，样品测定结果也增高，说明存在较强的基质效应。本方法测定的目标物为驴源性多肽A2，由于无法获得空白基质样品，因此采用同位素内标法消除基质效应。采用内标法测定不同稀释倍数的样品，结果稳定。同位素内标法确保了定量结果的准确性。

3.8 标准曲线、线性范围及定量限 分别将20、50、100、250、500 ng·mL-1的标准曲线工作溶液各2 μL注入液质联用仪中，以测得的峰面积比值Y为纵坐标，以驴源多肽A2的含量(ng·mL-1)X为横坐标制作标准曲线，得到线性回归方程Y=1.321 046X+0.040 333，相关系数r为0.999 6，在20～500 ng·mL-1浓度范围内，线性关系良好。

将标准溶液逐级稀释，以3倍信噪比的峰高对应的浓度定为方法检出限，为0.2 ng·mL-1，折合到阿胶糕样品中含量为0.05 mg·kg-1；以10倍信噪比的峰高对应的浓度为定量限，为0.6 ng·mL-1，折合到阿胶糕样品含量为0.15 mg·kg-1。

3.9 精密度 取样品按照按“2.3”项下样品前处理进行处理，进样测定，平行测定6次，考察方法精密度，测定结果的RSD为1.9%，方法重现性较好。

3.10 稳定性研究 分别考察了室温放置时间为0、1、3、5、7、14、20、24 h的标准溶液(1 000 ng·mL-1)及阿胶经酶解后样品溶液目标肽段的峰面积变化情况，在被考察的24 h内，驴源多肽A2在样品溶液和标准溶液中峰面积的RSD值分别为2.5%、3.1%，稳定性良好。

3.11 回收率 本方法通过向样品(含量为0.099 19 mg·g-1)，并通过向其添加低、中、高 3 个浓度水平的驴源多肽A2标准溶液，每个水平平行测定3次，计算方法回收率，结果见表3。

表3 3个水平下的加标回收率(n=9)

3.12 样品测定 采用本方法对不同生产企业以及市售阿胶糕样品进行测定，得到不同厂家不同工艺共21批次阿胶中驴源多肽A2的含量。不同厂家因生产工艺、原料等不同，所测得的驴源多肽A2的含量差异较大，含量为4.5%～21.7%。测定结果说明不同厂家产品质量差异较大，急需对产品进行质量控制。

表4 样品测定结果

4 结论

本研究建立了阿胶糕中驴皮源成分的检测方法，方法以特征肽为检测指标，采用超高效液相色谱-串联质谱测定，考察了样品前处理、酶解条件、色谱条件、基质效应，采用同位素内标法定量，方法准确度高。样品测定结果表明不同生产企业的产品驴皮源成分含量差异较大，说明产品质量参差不齐，提示部分生产企业需改进工艺提升产品品质，同时应注重阿胶原料的质量。本方法操作简便，结果可靠，重现性好，可用于阿胶糕中驴皮源成分的质量控制。