甘蓝强骨片急性毒性和长期毒性试验

周泽璇,张婷，梁国栋，刘卫东，肖云峰

(1.内蒙古大唐药业股份有限公司，内蒙古自治区 呼和浩特 010010；2.内蒙古自治区蒙药新药研发企业重点实验室，内蒙古自治区 呼和浩特 010010；3.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，内蒙古自治区 呼和浩特 010010)

蓝刺头是菊科植物多年生草本，以头状花序入药，属蒙医药常用传统蒙药材之一，最早记载于蒙古族著作《智慧之鉴》中，性味苦，凉，具有固骨质，接骨愈伤，清热止痛的功效，主要用于骨折、骨热、刺痛、疮疡等病症[1]。甘蓝强骨片是由本公司研发中心自主研发的一味特色蒙药，由蓝刺头、甘草、桑白皮三位味道地蒙药材组成，具有补脾益气、清热解毒、泻肺平喘、利水消肿、固骨质、清热止痛等功效，主要用于肝肾亏损之围绝经期、绝经期骨质疏松，尤其是对骨质疏松有一定的治疗效果，拥有良好的应用前景。

上市的药品必须具备安全、有效和质量可控三个条件[2]，其中药品的安全性关乎于人们的生命健康是重中之重，因此在药品上市之前必须通过毒性研究试验对药品的安全性做出评价。依据毒性研究技术指导原则[3-6]，本文通过开展甘蓝强骨片的急性毒性和长期毒性试验研究，观察动物产生的毒性反应及严重程度，对主要毒性反应靶器官的损害，评价甘蓝强骨片用药安全性，确定安全剂量，为临床用药提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物与饲养条件

1.1.1 动物 SPF级昆明种小鼠和SPF级Wistar种大鼠，均由内蒙古医科大学实验动物中心提供，生产许可证编号均为SCXK(蒙)2015-0001，使用许可证编号均为SYXK(蒙)2015-0001。购入后检疫适应环境7 d，并对动物外观健康、临床症状等情况观察，各项指标达到试验要求。

1.1.2 环境条件 温度20～26 ℃，日温差≤3 ℃；相对湿度41%～64%；换气次数≥15 次/h；照明时间12 h/12 h(07∶30～19∶30)明暗交替，照度150～300 Lux。

1.2 药品与试剂 甘蓝强骨片(内蒙古大唐药业股份有限公司生，批号：20200324)；水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂，批号：20181124)；羧甲基纤维素钠(Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC-Na，天津市致远化学试剂有限公司，批号：20190304)；血细胞分析试剂(深圳迈瑞生物股份有限公司，批号：2019030106)；谷丙转氨酶(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：191013563)；谷草转氨酶(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：200114305)；白蛋白(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：190923316)；总蛋白(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：200119101)；尿素(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：191201352)；肌酐(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：191222511)；葡萄糖(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：191107307)；总胆固醇(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：191007278)；甘油三酯(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：200119117)。

1.3 仪器 电子天平(北京塞多利斯仪器系统有限公司，型号：BS2202S、BS2402S)；实体解剖显微镜(德国Leica公司，型号：DFC 290)；封闭式全自动组织脱水机(德国徕卡，型号：ASP 200)；切片机(德国徕卡，型号： RM 2235)；自动染色机(德国徕卡，型号：AUTOSTAINER XL)；分体式组织包埋机(德国徕卡，型号：EG 1150 H)；烘片机(德国徕卡，型号：HI 1220)；摊片机(德国徕卡，型号：HI 1210)；倒置显微镜(德国徕卡，型号：DM3000)；全自动生化分析仪(爱尔兰蓝宝石公司，型号：ADS 600)；全自动血液细胞分析仪(希森美康集团，型号：Sysmex XT-1800i)。

2 实验方法

2.1 单次给药试验

2.1.1 动物分组与给药剂量 选取健康昆明种小鼠40只，适应性饲养7 d后，按性别、体重将小鼠随机分为溶剂对照组(0.5%CMC-Na)和供试品组(甘蓝强骨片)，每组20只，雌雄各半。根据药物急性毒性预试验，无法测出LD50，故采用急性毒性限度试验测定方法。配制药物最大可混悬浓度为0.847 1 g·mL-1，由于无临床给药剂量，采取单日内单次给予药物最大浓度剂量，小鼠按0.4 mL/10 g灌胃给药1次，总给药体积为40 mL·kg-1，给药剂量为33.86 g·(kg·d)-1。

2.1.2 观察、称重及检查 给药后观察动物的临床症状，连续观察至第14天，每天对动物进行体重、摄食量、饮水量测定和记录。第15天解剖动物，并进行大体病理学检查，若发现病变，则对病变组织进行组织病理学检查。

2.2 重复给药试验

2.2.1 动物分组与给药剂量 选取Wistar大鼠80只，体重51.0～77.3 g，适应性饲养7 d后，按体重随机分为4组，每组20只，雌雄各半。受试物按急性毒性试验设计剂量设4个剂量组，分别为高剂量组[22.50 g·(kg·d)-1]、中剂量组[11.25 g·(kg·d)-1]、低剂量组[0.45 g·(kg·d)-1]和溶剂对照组(0.5%CMC-Na)。各组均以40.0 mL·(kg·d)-1灌胃(溶剂对照组灌胃等容量0.5%CMC-Na)，每天一次灌胃给予受试药物，连续给药30 d。

2.2.2 观察、称重及检查 每天观察并记录动物的一般临床症状，每周测定并记录动物的体重及进食量。实验第31天，腹主动脉取血测定血清生化指标和血象指标，然后进行大体解剖，观察有无异常，取肝、肾、脾、睾丸等脏器称重，并将溶剂对照组和高剂量组动物的肝、肾、脾、胃肠、睾丸(卵巢)等脏器固定，进行组织病理学检查。

3 数据的统计与处理

4 结果

4.1 急性毒性试验

4.1.1 对动物临床症状的影响 给药后连续观察动物14 d，小鼠进食、进水、活动、毛色、粪便姿势、躯体运动、呼吸频率、下腹及肛门周围无污染、眼、鼻、口无分泌物、体温等一切正常。

4.1.2 对动物体重的影响 与溶剂对照组比较，供试品组雌雄小鼠体重未见明显差异(P>0.05)，结果见表1～2。

表1 甘蓝强骨片对小鼠体重的影响(♂,

表2 甘蓝强骨片对小鼠体重的影响(♀,

4.1.3 对动物摄食量的影响 供试品组小鼠摄食量与溶剂对照组基本一致，未见明显差异(P>0.05)，结果见表3～4。

表3 甘蓝强骨片对小鼠摄食量的影响(♂,

表4 甘蓝强骨片对小鼠摄食量的影响(♀,

4.1.4 对动物饮水量的影响 供试品组小鼠饮水量与溶剂对照组基本一致，未见明显差异(P>0.05)，结果见表5～6。

表5 甘蓝强骨片对小鼠饮水量的影响(♂,

4.1.5 病理学检查 大体病理学检查，肉眼观察组织、器官未发现异常或病变。

表6 甘蓝强骨片对小鼠饮水量的影响(♀,

4.2 长期毒性试验

4.2.1 对动物临床症状的影响 给药后连续观察动物2周，大鼠进食、进水、活动、毛色、粪便姿势、躯体运动、呼吸频率、下腹及肛门周围有无污染、眼、鼻、口有无分泌物、体温等一切正常。

4.2.2 对动物体重的影响 与溶剂对照组比较，供试品组大鼠体重未见明显差异(P>0.05)，结果见表7～8。

表7 甘蓝强骨片对大鼠体重的影响(♂,

表8 甘蓝强骨片对大鼠体重的影响(♀,

4.2.3 对动物摄食量的影响 与溶剂对照组比较，供试品组大鼠摄食量无明显差异(P>0.05)，结果见表9～10。

表9 甘蓝强骨片对大鼠摄食量的影响(♂,

4.2.4 对大鼠血常规的影响 与溶剂对照组相比，供试品组大鼠血常规各指标未见明显差异(P>0.05)，主要指标见表11～12。

表10 甘蓝强骨片对大鼠摄食量的影响(♀,

表11 甘蓝强骨片对大鼠血常规的影响(♂,

4.2.5 对大鼠生化指标的影响 与溶剂对照组相比，供试品组雄鼠肌酐及甘蓝强骨片22.50 g·(kg·d)-1组总胆固醇均明显低于溶剂对照组(P<0.05、P<0.01)，但无生物学意义。其余供试组与溶剂对照组基本一致，无明显差异(P>0.05)，主要指标见表13～16。

表12 甘蓝强骨片对大鼠血常规的影响(♀,

表13 甘蓝强骨片对大鼠生化指标的影响(♂,

表14 甘蓝强骨片对大鼠生化指标的影响(♀,

表15 甘蓝强骨片对大鼠生化指标的影响(♂,

表16 甘蓝强骨片对大鼠生化指标的影响(♀,

4.2.3 病理学检查

4.2.3.1 大体解剖观察 与溶剂对照组相比，供试品组大鼠大体解剖和脏体比结果未见明显差异(P>0.05),主要指标见表17～18。

表17 甘蓝强骨片对大鼠脏体比的影响(♂,

表18 甘蓝强骨片对大鼠脏体比的影响(♀,

4.2.3.2 组织病理学检查 各主要脏器大体检查未发现明显病变，因此选择高剂量组和溶剂对照组作组织病理学检查。高剂量给药组雌雄鼠各有2只肝脏小叶出现轻度的空泡变、颗粒变和肝细胞肿胀，溶剂对照组有2只雌鼠、3只雄鼠肝脏小叶细胞出现轻度的空泡变、颗粒变和肝细胞肿胀；高剂量组和溶剂对照组各有1只雌鼠、2只雄鼠肝脏汇管区出现轻度的炎症细胞浸润，各有1只雌鼠肾脏皮质部肾小管有轻度肿胀，各有1只雄鼠脾脏有轻度的色素沉着；溶剂对照组有1只雌鼠卵巢有轻度囊肿。以上组织病变均属于动物自发病变，高剂量组雌、雄鼠其他脏器均未见明显的与供试品毒性有关的病理病变，结果见图1所示。

图1 高剂量甘蓝强骨片大鼠肝(A)、脾(B)、胃(C)、肾(D)、十二指肠(E)、结肠(F)、卵巢(G)和睾丸(H)组织切片

5 结论与讨论

甘蓝强骨片由蓝刺头、甘草、桑白皮三位味道地蒙药材组成。其中，蓝刺头是甘蓝强骨片中针对主病证起主要治疗作用的一味药材，具有抑制骨吸收，促进骨形成，对骨吸收和骨形成偶连有一定的调节作用，降低骨转化率从而可以达到防止骨质疏松[7]。有研究表明[8]，蓝刺头多糖提取物无毒副作用，此外未见其他蓝刺头药材毒性研究报道。甘草味甘、性平，是能够调和诸药的一味药材，与烈性药物配伍可缓和药性功效[9-10]。桑白皮药材来源于桑科植物桑的干燥根皮，具有良好的抗骨质疏松的作用[11]，早期有研究表明桑白皮药材无毒性作用[12-13]。

本实验通过对昆明种小鼠灌胃给予甘蓝强骨片颗粒，按0.4 mL·(10 g)-1灌胃给药，一日内给药1次，总给药量为40 mL·kg-1，饲养观察2周，小鼠无任何异常及中毒反应，行为、活动、进食一切正常，体重增加，说明甘蓝强骨片在低于33.86 g·(kg·d)-1剂量条件下无急性毒性作用。通过对Wistar种大鼠灌胃给予甘蓝强骨片颗粒，在试验剂量22.50、11.25和0.45 g·(kg·d)-1对实验大鼠的生长发育、血液学、血液生化学及病理学方面各项相关指标的检验均未发现明显不良影响，说明甘蓝强骨片口服给药为无毒或低毒。

实验同期课题组开展了甘蓝强骨片的药效学研究，研究结果表明甘蓝强骨片对骨质疏松有一定的治疗效果。甘蓝强骨片作为治疗骨质疏松的一种全新中药产品，对于骨质疏松患者的用药提供了新的选择。本实验研究结果表明甘蓝强骨片给药为无毒或低毒为其安全性评价奠定了基础，同时为后续的临床用药试验提供了理论支撑。