二氢杨梅素可逆转SKBR3细胞对赫赛汀的耐药：基于上调miR-98-5p抑制IGF1R/HER2二聚体形成

人表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌约占新发乳腺癌比例的20%～25%，早期研究发现其与预后不良相关。人源化抗HER2单克隆抗体赫赛汀，是一种有效的抗HER2靶向药物，极大地提高了HER2阳性乳腺癌患者的生存率，已被写入诊疗指南。然而，并不是所有HER2阳性乳腺癌患者对赫赛汀的治疗都有良好反应，临床研究发现原发性及获得性赫赛汀耐药占30%～50%，失去有效治疗后的部分患者最终发生肿瘤复发和远处转移，占乳腺癌死亡的90%。因此，赫赛汀耐药成为HER2阳性乳腺癌临床治疗的一个重大障碍。迄今为止，依然缺乏有效预测赫赛汀疗效的生物标志物以及克服耐药的方法。

我们前期研究发现，赫赛汀耐药细胞中胰岛素样表皮生长因子1受体（IGF1-R）下游信号通路IGF1R/AKT异常激活，天然黄酮类化合物二氢杨梅素（DMY）可抑制此通路激活，逆转SKBR3乳腺癌细胞对赫赛汀耐药。胰岛素样生长因子2（IGF2）是IGF1-R的内源性配体，IGF2与IGF-1R特异性结合后，磷酸化特异性胞内信号蛋白—胰岛素受体底物1（IRS1），激活下游的丝裂原激活的蛋白激酶和磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号转导，进而调节细胞的生长增殖及侵袭转移。miR-98-5p是一种小分子非编码MicroRNA，通过生物信息学数据库TargetScan 预测其可靶向结合IGF2 mRNA 3'UTR，而目前对于miR-98-5p通过靶向调控IGF2表达影响HER2阳性乳腺癌细胞对赫赛汀的敏感性，尚未见报道。

100例患者随机分组后，观察组54例，对照组46例，两组的年龄、性别、病程和文化程度等方面分别比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

本研究通过细胞实验验证miR-98-5p/IGF2轴对赫赛汀敏感性的影响，然后建立裸鼠异种移植肿瘤模型，进一步探索二氢杨梅素对miR-98-5p/IGF2调控轴的影响，以及在体内逆转赫赛汀耐药性的可能机制。为临床提高HER2阳性乳腺癌赫赛汀治疗的疗效提供新思路，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 试剂和细胞

重组人IGF2（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）。Western blot 检测中使用的主要抗体：IGF2、IRS1、IGF-1R、p-IGF-1R/IR、Akt、p-Akt、p-Akt、S6K、p-S6K、HER2、β-actin（Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）。实验所用的所有引物均采用Primer3 input设计，南京金斯瑞公司合成。人HER2阳性乳腺癌细胞系SKBR3（ATCC，Manassas，VA），保存在含10%胎牛血清的DMEM培养基中（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。耐药细胞株的培养和鉴定参见本研究组既往研究文献［5］。

1.2 异种移植肿瘤模型建立

动物实验获得蚌埠医学院动物保护与使用委员会（IACUC）批准（批准文号：［2020］No.203）。按照IACUC协议遵循标准的动物饲养和实验室指南。小鼠被饲养在单独通风的笼子中，在标准室温（22 ℃）和湿度（55%）下，光照/黑暗周期为12/12。将肿瘤细胞接种于Balb/C裸鼠（购自蚌埠医学院实验动物中心）腋窝皮下，产生异种移植瘤。当肿瘤大小达到100 mm时，将小鼠随机分为：实验组：二氢杨梅素灌胃（DMY 25 mg·g·d）+腹腔注射赫赛汀（100 μg·g·w）；对照组：腹腔注射赫赛汀（100 μg·g·w）；空白组：腹腔注射PBS；=5/组。治疗共6周，每7 d游标卡尺测量一次肿瘤大小，计算肿瘤体积。

1.3 细胞转染

用含有特异性shRNA的psi-LVRU6GP载体转染细胞（慢病毒转染），并用嘌呤霉素（2 μg/mL）筛选，以建立基因敲除或过表达的转染物。分别使用Lipofectamin 3000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）转染miRNA模拟物或抑制剂（Ribobio）。

1.4 免疫印迹

RIPA缓冲液从细胞中提取总蛋白。BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。将等量的蛋白质与5×Lane Marker还原样品缓冲液混合，用SDS聚丙烯酰胺凝胶溶解，然后转移到Immobilon-P 转移膜（Millipore，Burlington Mass，USA）上。用5%的脱脂牛奶在Tris缓冲盐水中封闭细胞膜，然后用一抗和二抗孵育。采用增强化学发光Western blot 检测试剂盒检测信号。用ImageJ软件（v2.0.0）对信号进行密度分析。

1.5 总RNA和miRNA的分离和RT-qPCR

RNA分离试剂盒（QIAGEN，Hilden，Germany）按照说明书从细胞中分离出总RNA。RT-qPCR 采用CFX96 Real-Time PCR 系统（Foster City，California，USA）。采用β-actin作为内参。从培养的细胞中分离出miRNAs，并用miRCURY RNA Isolation Kit（Exiqon,Vedbaek,Denmark）纯化。miRNA 序列特异性RTPCR引物和内源对照RNU6购自GeneCopoeia。通过RNU6归一化计算相对定量表达。

1.6 细胞增殖及侵袭实验

使用CellTiter 96AQueous One Solution细胞增殖检测试剂盒（Promega，Madison，WI，USA）进行细胞增殖（MTS）检测。用不同浓度的赫赛汀，以2000/孔（0.20 mL/孔）的浓度将细胞接种到96孔板上。MTS孵育第2天测定细胞活力（0.02 mL/孔）。孵育2 h后，在BioTek Synergy 2系统上记录各孔在490 nm处的吸光度，用以代表细胞活力，并计算各时间点的细胞活力。取处于对数生长期细胞，经过消化、离心、PB5S清洗和无血清培养基重悬。取待测细胞悬液加入Transwell小室，1×10/孔，×24孔板，37 ℃、5%CO培养箱过夜。取出弃去培养液，PBS清洗2遍，4%甲醛固定过夜。0.1%结晶紫染色30 min，棉签轻拭去上层细胞，PBS清洗3遍，显微镜拍照（×100），选取3～5个非重复视野，并进行计数。

1.7 荧光素酶报告实验

SKBR3-R细胞相较于SKBR3细胞，对赫赛汀的敏感性降低（＜0.01），值分别为220.53±12.21 μg/mL和23.52±2.02 μg/mL（图1A）。

1.8 免疫共沉淀

免疫沉淀在4 ℃下用特异性Ab或IgG进行过夜（阴性对照）。用蛋白g-琼脂糖（Amersham Biosciences）孵育免疫沉淀2 h。反应产物用裂解缓冲液洗涤，免疫复合物用SDS-PAGE 进行溶解，进行Western blot 检测，采用β-actin作为内参。

1.9 免疫组化

所有连续数据均符合正态分布，以均数±标准差表示。利用SPSS 19.0和GraphPad Prism 9进行统计分析和绘图，组间比较采用检验，＜0.05为差异有统计学意义。Kaplan-Meier plotter 生成患者生存曲线（https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast）。

1.10 统计学分析

经福尔马林固定和石蜡包埋后的组织切成4 μm切片。在62 ℃干燥2 h后，在二甲苯中分离脱蜡，依次使用等浓度梯度的乙醇处理。经过抗原修复，然后用3%过氧化氢在甲醇中处理玻片15 min。采用0.01 mol/L环酸钠缓冲液（pH 6.0）微波提取抗原，以达到抑制内源性过氧化物酶活性的目的。在10%山羊血清中预孵育1 h后，将标本与一抗在4 ℃下孵育过夜。根据产品说明书，使用了辣根过氧化物酶检测系统（DAKO，Glostrup，Denmark）。阅片由两位高年资病理科医师独立完成。

2 结果

2.1 SKBR3及SKBR3-R细胞中IGF2表达及其介导的IGF-1R/IRS1/AKT信号通路激活

将IGF2 mRNA 3'UTR的基因序列克隆到萤火虫荧光素酶报告基因下游的pMir-Report质粒中。将细胞接种到96孔板上，用pMir-Report荧光素酶载体共转染。转染48 h后，使用BioTek Synergy 2上的双荧光素酶报告基因检测系统（Promega）测定荧光素酶活性。以Renilla荧光素酶活性作为内对照，以Renilla荧光素酶活性归一化后的SD平均值计算萤火虫荧光素酶活性。

甘草提取物对雷公藤甲素损伤后人肝L-02细胞中UGT1A、MRP2表达的影响 …………………………… 张 靖等（1）： 65

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检索生物信息学数据库TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/），预测IGF2 mRNA 的3'-UTR中许多具有保守结合位点的miRNAs。通过context scores和Pct对预测结果的可能性进行评分，其中miR-98-5p具有高靶向结合可能性（图4）。荧光素酶报告实验发现，miR-98-5p inhibitor增强了SKBR3细胞中野生型报告基因的荧光素酶活性（＜0.05），而不是突变结合位点型（＞0.05）。miR-98-5p mimic抑制了SKBR3-R细胞中野生型报告基因的荧光素酶活性（＜0.05），而不是的突变型的（＞0.05，图5）。

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Western blot检测发现，SKBR3及SKBR3-R细胞中蛋白相对含量p-IGF1R（0.20±0.101.02±0.43，＜0.01）；p-Akt（0.32±0.121.22±0.34，＜0.01）；p-S6K（0.50±0.151.35±0.60，＜0.05）；PTEN（1.39±0.550.60±0.14，＜0.05）差异均有统计学意义（图2）。

2.2 IGF1-R/HER2异源二聚体形成

免疫沉淀法结果显示，SKBR3-R 细胞CM 中IGF1R/HER2异源二聚体与HER2含量比值高于SKBR3细胞［（70±12.30）%（17±1.95）%，＜0.01，图3）］。

2.3 miR-98-5p与IGF2靶向相互作用

SKBR3 及SKBR3-R 细胞条件培养基（CM）内，IGF2 mRNA相对表达量差异无统计学意义（=0.129）；IGF2蛋白表达水平差异有统计学意义（22.52±3.79 ng/mL101.12±11.26 ng/mL，＜0.01，图1B）。

SKBR3空白对照组侵袭细胞数为75.23±11.12，导入miR-98-5p mimic后侵袭细胞数21.89±7.23，差异有统计学意义（＜0.01）；导入miR-98-5p inhibit后侵袭细胞数为98.91±9.52，差异有统计学意义（＜0.05，图7）。

2.4 miR-98-5p 靶向调控IGF2蛋白表达

SKBR3细胞中导入miR-98-5p inhibitor时，细胞内IGF2含量增加（＜0.01）；同样将SKBR3-R细胞中导入miR-98-5p mimic 时，细胞内IGF2 含量下降（＜0.01，图6）。

2.5 miR-98-5p 对SKBR3细胞侵袭性的影响

城市轨道交通的车辆密度大，运输量较高，在工程设计上，主要以行车间隔缩短为主。在该种方式的作用下，可以进一步提升服务质量，降低旅客的候车时间以及工程总体投资数额。但在信号ATP系统的作用下，该项操作的实际效果并没有很好的体现出来，如“车、地”通信速率、轨道区段长度等因素，在具体应用过程中不能将行车距离无限缩短，而且最小行车间隔对整个系统方案设计影响较大。信号ATP系统的出现，主要是利用各种控制参数来确定行车间隔。站在实际工程角度来说，应该以实际施工方案内容内容、线路、距离等综合因素为主，建立起一个合理的投资计划，最终满足车辆信号系统的设计要求。

2.6 裸鼠异种移植肿瘤模型建立及相关分子表达

赫赛汀能抑制SKBR3细胞异种移植肿瘤的生长，但对SKBR3-R细胞异种移植肿瘤生长影响减小。第6周测量肿瘤最大径分别为5.5±1.7 mm和27.5±5.8 mm，差异具有统计学意义（＜0.05，图8）。达到实验终点后，切取肿瘤组织，免疫组化发现赫赛汀耐药肿瘤组织中IGF2、磷酸化IGF-1R（p-IGF1R）、Akt（p-Akt）、S6K（p-S6K）含量水平高于赫赛汀敏感肿瘤组织（图9）。

2.7 二氢杨梅素在体内增加SKBR3-R细胞异种移植瘤对赫赛汀敏感性

裸鼠移植肿瘤体积达到～100 mm时，将小鼠随机分3组，第6周瘤体积达到最大，3组分别为213.3±10.6 mm、605.5±8.8 mm、689.3±20.3 mm，差异有统计学意义（＜0.05，图10）。

2.8 二氢杨梅素在体内通过miR-98-5p调节IGF2转录后表达水平

miR-98-5p在实验组相对表达量4.32±0.88、对照组1.19±0.25、空白组1.10±0.27，差异有统计学意义（＜0.01）。IGF2 mRNA在3组相对表达量差异无统计学意义（＞0.05）。IGF2蛋白表达量在实验组、对照组、空白组的差异有统计学意义（75.83±3.29208.3±12.11218.5±13.71，＜0.01，图11）。

3 讨论

HER2属于生长因子受体家族成员，其在乳腺癌中过表达是促进癌细胞侵袭增殖的重要因素，与患者的预后密切相关。抗HER2靶向药物赫赛汀可有效阻滞HER2信号传导，起到抗肿瘤作用，HER2阳性乳腺癌患者的生存期得到显著提高，但是耐药患者的预后依然较差。攻克耐药是临床面临的重大挑战。HER2的特殊性在于体内缺乏天然配体，受体通过与自身或者其他生长因子受体家族形成同源或异源二聚体，激活下游信号通路，如PI3K/AKT通路。胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）信号通路的异常激活在赫赛汀耐药中的重要性已越来越受到重视，寻找调控信号通路的特异性靶点来逆转赫赛汀耐药，是当前基础研究的热点。有研究发现，在HER2阳性人乳腺癌细胞中，IGF2/IGF-1R/IRS1信号被负反馈抑制，以维持基本的细胞生存和增殖。当这种负反馈被打破后，IGF-1R可通过自身下游信号通路激活使细胞对赫赛汀敏感性降低。本研究证实了上述结论，我们进一步发现赫赛汀诱导耐药的SKBR3-R细胞中IGF-1R/HER2异源二聚体含量显著增多，细胞通过这种方式对赫赛汀产生耐药。有研究亦有报导，但没有分析二聚体形成的原因。虽然IGF1R与HER2 有着共同的AKT/mTOR 下游信号通路，但IGF-1R 胞内区特有的信号分子胰岛素受体底物1（IRS1）是否激活是与HER2介导下游信号通路相鉴别的重要方法。研究表明，IRS1激活会通过AKT信号通路促进肿瘤生长。IGF2/IGF-1R/IRS1信号通路还与恶性肿瘤细胞之间的黏附过程有关，对癌细胞表型维持以及抗肿瘤治疗耐药过程中起了重要作用。本研究发现，随着IGF2水平的升高，SKBR3细胞的侵袭性显著增强，同时对赫赛汀敏感性显著降低。有研究亦发现IGF2水平升高促进乳腺癌细胞的转移。本研究发现赫赛汀耐药乳腺癌细胞高表达IGF2，并且细胞膜内IRS1磷酸化水平显著升高。细胞内IGF2水平升高后，激活IGF1-R/HER2 异源二聚体大量形成，并通过IGF1-R 下游IRS1 介导的信号通路旁路激活AKT/mTOR，可能是导致SKBR3-R细胞对赫赛汀耐药的重要原因。

本研究发现，SKBR3-R 细胞与SKBR3 细胞内IGF2 mRNA水平并无显著差异，而IGF2蛋白含量在耐药细胞中却显著升高。提示很可能IGF2在mRNA转录后受到了调控。IGF2在肿瘤中表达水平受到上游基因调控在其他肿瘤中常有报道。MicroRNA是生物体内最常见非编码RNA之一，它们的主要功能就是结合目标mRNA并调控转录。检索生物信息学数据库TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/），预测IGF2 mRNA 的3'-UTR 中许多具有保守结合位点的miRNAs。Context scores和Pct对预测结果的可能性进行评分，其中miR-98-5p具有高靶向结合可能性。同时miR-98-5p也已被证实在多种癌症中均具有抑制肿瘤生长和转移的作用，本研究进一步通过荧光素酶报告基因确定了miR-98-5p与IGF2存在靶向作用关系，表明miR-98-5p参与了IGF2的表达调控。本研究发现转染了miR-98-5p mimic的SKBR3细胞，IGF2蛋白表达下降，侵袭性显著降低，验证了miR-98-5p/IGF2调控轴在细胞侵袭中的重要作用。

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在我们既往研究中发现，黄酮类天然化合物DMY有显著抑制乳腺癌细胞增殖的能力，可能的机制就是抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活。并且通过体内实验验证了DMY在裸鼠体内的安全有效的灌胃剂量为25 mg/g·d。本研究在前期研究基础上发现，DMY显著降低了SKBR3-R裸鼠异种移植肿瘤组织内AKT/mTOR信号通路关键分子磷酸化水平，同时有效地逆转了赫赛汀耐药。肿瘤组织中miR-98-5p表达量在含DMY 治疗组显著高于未加入DMY 治疗组，而IGF2蛋白水平正好相反。提示DMY可能是通过miR-98-5p下调IGF2表达，进而抑制IGF-1R下游信号通路的旁路激活，逆转细胞对赫赛汀耐药。对于DMY通过microRNA途径调控效应蛋白的表达，在既往的研究中同样有报道。其具体机制有待进一步研究。

综上所述，HER2过表达的乳腺癌细胞中IGF2高表达可促进IGF-1R/HER2异源二聚体形成，并激活下游信号通路造成赫赛汀耐药。二氢杨梅素可以诱导miR-98-5p表达，降低IGF2水平，从而逆转HER2阳性乳腺癌细胞对赫赛汀耐药。本研究首次探究了SKBR3细胞中miR-98-5p/IGF2调控轴参与对赫赛汀耐药以及二氢杨梅素逆转细胞耐药的可能机制，为临床上克服赫赛汀继发耐药提供新的思路，值得进一步深入研究。