一测多评法同时测定天芷金黄贴膏中5种活性成分含量的适用性研究

谭娥玉，马少锋，章光华，李 放，王贤儿，林信亨

（江门市五邑中医院，广东 江门 529000）

天芷金黄贴膏源自如意金黄散，记载于明代陈实功编著的《外科正宗》，由大黄、黄柏、厚朴、姜黄、白芷、陈皮、甘草、苍术、天南星、天花粉10 味中药组成［1］，用于热毒瘀滞肌肤所致疮疡肿痛、丹毒流注，症见肤红、肿、热、痛，亦可用于跌打损伤［2］。天芷金黄方在我院临床上使用40余年，本课题组在前期研究中通过优化提取工艺及制备工艺，已将其成功制备为凝胶贴膏［2］。单一成分质控模式对中药复方制剂具有局限性，一测多评法（QAMS）广泛应用于中药及复方制剂的质控研究［3-10］。为了有效控制制剂质量，本实验结合QAMS建立方中主要药味的有效成分含量测定方法，采用HPLC 法同时测定大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、盐酸小檗碱、厚朴酚的含量，研究一测多评法在天芷金黄贴膏质量评价中的可行性和准确性，为天芷金黄贴膏的质量控制和评价提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；LC-10 型高效液相色谱仪（日本岛津企业管理公司）；Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent 公司）；Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent公司）；岛津VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm，日本岛津企业管理公司）；XS205 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司，感量：0.01 mg）；WH-800 超声波清洗机（济宁万和超声电子设备有限公司）；Best-S30 超纯水机（芷昂仪器上海有限公司）；SHZ-DⅢ循环水真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；DLSB-10/20 低温冷却循环泵（巩义市予华仪器有限公司）；RE-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药与试剂 盐酸小檗碱对照品（批号：0713-9906，纯度：98.14%）、厚朴酚对照品（批号：110729-201714，纯度：100%）由中国食品药品检定研究院提供；大黄酚对照品（批号：MUST-17041310，纯度：99.50%）、大黄素对照品（批号：MUST-17102702，纯度：99.48%）、大黄素甲醚对照品（批号：MUST-17102702，纯度：99.00%）由成都曼思特生物科技有限公司提供；天芷金黄贴膏（自制，批号：20190805、20190809、20190820、20190903、20190911、20190915）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸、盐酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 分别称取盐酸小檗碱、厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，同置于25 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，制成浓度分别为盐酸小檗碱0.260 8 mg/ml、厚朴酚0.088 0 mg/ml、大黄素0.042 0 mg/ml、大黄酚0.065 6 mg/ml 及大黄素甲醚0.033 2 mg/ml 的混合对照品储备液，置于4 ℃冰箱保存。

2.2 供试品溶液制备 取天芷金黄贴膏半片，约23 g，剪碎，精密称定，置于250 ml 具塞锥形瓶中，加入1%HCl 甲醇溶液 100 ml，浸渍 3 h，超声 30 min，抽滤，滤液使用旋转蒸发仪蒸发浓缩，浓缩液转移至25 ml量瓶中，并用适量甲醇洗涤烧瓶3～4次，洗涤液也并入容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 阴性溶液的制备 按处方称取除大黄、黄柏、厚朴外的各味中药，制成阴性样品，再按“2.2”的方法制备阴性对照溶液。

2.4 色谱条件与系统适用性试验［2，11］Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液A-甲醇B，梯度洗脱：0～5 min，67%A～67%A；5～7 min，67%A～57%A；7～17 min，57%A～57%A；17～19 min，57%A～18%A；19～45 min，18%A～18%A；流速为1 ml/min，检测波长为254 nm；柱温为30 ℃；进样量为5 μl。在此色谱条件下，各成分分离度高，阴性对照无干扰，结果见图1。

图1 HPLC色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下混合对照品储备液各 1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml、6.0 ml、8.0 ml于10 ml 量瓶中，用甲醇稀释并定容，制得系列混合对照品溶液。将各混合对照品溶液及混合对照品储备液，按“2.4”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，混合对照品浓度（X，μg/ml）为横坐标，进行线性回归计算，结果见表1。

表1 各化学成分标准曲线 （n=6）

2.5.2 定量限与检测限考察 精密吸取“2.1”项下对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。按信噪比为10∶1、3∶1 分别计算定量限、检测限。结果，盐酸小檗碱、厚朴酚、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚定量限分别为7.98 ng/ml、6.62 ng/ml、4.06 ng/ml、0.66 ng/ml、2.72 ng/ml，检测限分别为 2.39 ng/ml、1.98 ng/ml、1.22 ng/ml、0.20 ng/ml、0.82 ng/ml。

2.5.3 仪器精密度试验 取上述混合对照品溶液，按“2.4”项色谱条件连续进样6次，每次5 μl，测定盐酸小檗碱、厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，其RSD 分别为0.65%、0.33%、0.49%、0.16%、0.57%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取样品（批号：20190805）适量，按“2.2”项下制备供试品溶液，分别于制备后的0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h 进样，在“2.4”项色谱条件下每次进样5 μl，测定盐酸小檗碱、厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，其RSD 分别为0.24%、0.63%、0.50%、0.67%、0.86%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取样品（批号：20190805）6 份，按“2.2”项方法制备供试品溶液，进样分析，计算盐酸小檗碱、厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为 0.131 1 mg/g、0.063 3 mg/g、0.026 9 mg/g、0.038 7 mg/g、0.015 7 mg/g，以平均含量计算，结果RSD值分别为0.30%、0.61%、0.39%、0.67%、0.88%，结果表明方法重复性良好。

2.5.6 加样回收试验 取已知含量的样品（批号：20190805，盐酸小檗碱、厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量分别为0.131 5 mg/g、0.063 0 mg/g、0.027 2 mg/g、0.039 1 mg/g、0.015 2 mg/g）6份，每份10 g，精密称定，剪碎置于250 ml 具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液（盐酸小檗碱、厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的浓度分别为0.658 mg/ml、0.315 mg/ml、0.136 mg/ml、0.196 mg/ml、0.076 mg/ml）2 ml，按“2.2”项下制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下测定峰面积，由回归方程计算盐酸小檗碱、厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，并计算平均回收率和RSD，见表2。

表2 加样回收试验结果 （n=6）

2.6 待测指标的相对校正因子的计算 以盐酸小檗碱为内参物，在上述特定的范围内按照公式fs/i=（As/ns）/（Ai/n）i计算，As和 ns为内参物的峰面积和浓度，Ai和ni为待测成分对照品的峰面积和浓度。精密量取“2.1”项混合对照品溶液，分别进样 2 μl、4 μl、5 μl、6 μl、8 μl、10 μl，计算各个成分的峰面积。以盐酸小檗碱为内参物，计算厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚相对于盐酸小檗碱的相对校正因子。结果见表3。

表3 待测指标的相对校正因子

2.7 校正因子耐用性考察

2.7.1 不同仪器及色谱柱对相对校正因子的影响 采用2 台不同的仪器和3 根不同型号的色谱柱，分别考察其对盐酸小檗碱相对校正因子的影响，结果见表4。

表4 不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响

2.7.2 不同柱温对相对校正因子的影响 采用Agilent 1260 高效液相系统和Agilent XDB-C18 色谱柱，分别考察不同柱温（29 ℃、30 ℃、31 ℃）对盐酸小檗碱相对校正因子的影响，结果见表5。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响

2.7.3 待测成分的色谱峰定位 本实验采用相对保留时间对待测成分色谱峰进行定位，即各待测成分与盐酸小檗碱间保留时间的比值，并考察相对保留值在不同品牌高效液相色谱仪和不同型号色谱柱上的重现性，结果见表6。

表6 待测成分的色谱峰定位-相对保留值法

2.8 一测多评法与外标法的比较 取6 批次的样品，按“2.2”项的方法制备供试品溶液，并按“2.4”项的色谱条件下进样。分别采用外标法和一测多评法计算天芷金黄贴膏中盐酸小檗碱、厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，并利用夹角余弦算法来评价两种方法的差异性，测得外标法和一测多评法之间的相似度为0.999 9，表明两种方法测得的含量无显著性差异，结果见表7。

表7 外标法和一测多评法测定天芷金黄贴膏各指标成分含量的比较 （mg/g）

3 讨 论

方中黄柏、大黄、厚朴为主药，黄柏具有泻火解毒、清热燥湿的功效，黄柏中小檗碱有抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤等作用［12］；大黄具有泻下攻积、清热泻火、活血化瘀等功效，蒽醌类是其有效活性成分，有抗菌消炎、抗病毒、抗癌、保肝利胆等作用［13］；厚朴酚是厚朴主要活性物质之一，其对消化、神经、心血管与呼吸系统等均具有明显的药理活性［14］。由于盐酸小檗碱对照品廉价易得，且在供试品中，盐酸小檗碱的含量明显比其它成分（厚朴酚、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚）高，因此选择盐酸小檗碱作为内参物，计算内参物与其它待测成分间的相对校正因子。

预试验中曾分别考察了水-甲醇系统、水-乙腈系统、0.1%磷酸水溶液-甲醇系统、0.2%磷酸水溶液-甲醇系统，结果采用0.1%磷酸水溶液-甲醇作为流动相系统时各成分的峰形较好，分离度较理想。参考相关文献的液相洗脱条件［2，11］，最终确定本实验 HPLC 梯度洗脱在45 min 内完成5 个成分的同时分析测定，大大提高了分析效率。

待测组分色谱峰的准确定位是一测多评成功应用的关键［15］，本实验考察了相对保留时间和保留时间差在不同仪器和不同色谱柱的重现性。结果表明，保留时间差法在不同仪器中的重现性较不稳定，大黄素甲醚色谱峰的保留时间差RSD＞5%，而采用相对保留时间法，所有待测成分峰的相对保留时间相对稳定，其RSD 均＜5%。因此，确定使用相对保留时间法定位色谱峰。

医院制剂作为药品的一种特殊补充形式，长期以来，因其便捷、有效等特点在临床诊疗服务中发挥着重要作用。医院制剂质量标准制定目的是为了保证药品的安全、有效和质量稳定。然而，由于各医疗机构制剂水平、科研仪器设备等原因，很多医院制剂在标准制订的内容上与国家规范存在一定差距，控制指标参差不齐，不能达到质量控制的要求。一测多评法是一种多成分质控模式，适用于中药复方制剂的标准制订，本实验探索其应用于天芷金黄贴膏定量分析的可行性和准确性，为该法应用于医院制剂的质量标准制订提供一定参考。