微生物发酵法制备鲜辣沙蟹汁工艺研究

崔莹莹，李明燕，翟兴伟，童光森

(四川旅游学院 烹饪学院，成都 610100)

沙蟹汁是北部湾沿海特有的发酵类调味品，其味道鲜美，常用来烹饪沙蟹汁焖豆角等口味咸鲜的菜肴，亦可以作为白切类菜肴、各式火锅的蘸料，拥有非常好的市场潜力[1]。但是因传统沙蟹汁以海滩野生沙蟹作为原料，经初加工处理后加盐进行自然发酵，腥异味较重，对其推广有一定的制约。

微生物发酵法是食品工业常用的风味改良方法，通过微生物发酵作用将发酵类制品中的腥异味物质转化为无腥异味或降低腥异味程度，同时还能丰富发酵类制品的醇厚度，从而进一步提升发酵类制品的品质[2]。目前发酵制品生产企业多采用复合菌种混合发酵方法，在缩短发酵周期的同时还能弥补单一菌种发酵的缺陷。传统沙蟹汁以咸鲜口味为主，口味较为单一，除微生物发酵法对其发酵过程中的腥异味有一定的抑制作用外，还可以通过添加其他风味食材进一步改良其风味。鲜辣风味目前在国内餐饮中较受欢迎，在保留咸鲜风味基础上增加了辣味，不仅能开胃改善味觉感受，而且能起到增鲜解腻的作用。在沙蟹汁的制备过程中增加辣味食材，不仅能进一步改良其风味，而且能丰富沙蟹汁产品的种类，为餐饮行业提供一款鲜辣咸鲜的调味制品，进一步满足消费者的需求。

基于此，本文以沙蟹与辣椒为原料，在传统发酵工艺的基础上添加鲁氏酵母菌和植物乳杆菌进行发酵，通过单因素实验与正交实验进一步优化鲜辣沙蟹汁的制备工艺，并比较分析微生物发酵法制备的鲜辣沙蟹汁与传统发酵法的风味差异，为沙蟹汁系列产品的开发提供了参考，为相关研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 食材和试剂

沙蟹：购于北海市鲜而美食品有限公司；辣椒、盐：购于成都市青羊区麦德龙超市；植物乳杆菌和鲁氏酵母菌：购于中国科学院成都生物研究所；MRS液体培养基、YPD液体培养基：购于成都市富瑞达生物技术有限公司；其他试剂：均为国产分析纯。

1.1.2 仪器和设备

DC-PB02多功能料理机 合肥荣事达电子电器集团有限公司；HT-400B恒温培养箱 上海赫田科学仪器有限公司；GJB1000-60均质机 常州市均质机械有限公司；L-8900氨基酸分析仪 日立公司；LC210高效液相色谱仪 上海仪电分析仪器有限公司；DL5M冷冻离心机 盐城市凯特实验仪器有限公司；其他设备由四川旅游学院烹饪科学重点实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜辣沙蟹汁的制备与处理

1.2.1.1 发酵菌种制备

参考陈蕾蕾等[3]的方法。将植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中，于恒温培养箱在35 ℃条件下振荡培养15 h至活力恢复。将鲁氏酵母菌接种到YPD液体培养基中，于恒温培养箱在30 ℃条件下振荡培养35 h至活力恢复。培养结束后将两种菌悬液分别在4 ℃条件下以4000 r/min离心15 min，收集菌体沉淀并溶于0.85%灭菌生理盐水中，分别调整浓度为108CFU/mL，通过两种菌种单独发酵实验确定最佳接种量，并确定混合比例。

1.2.1.2 传统发酵法制备

参考刘天天[4]的方法。在预实验基础上按微生物发酵法最佳原料配方取沙蟹、辣椒、盐混合，放入多功能料理机中速粉碎3 min，加入蒸馏水500 g，然后放入均质机以6000 r/min均质10 min，放入发酵罐中，常温晾晒发酵25 d，成品即为传统发酵法制备鲜辣沙蟹汁。

1.2.1.3 微生物发酵法制备

参考范思华[5]的方法。在预实验基础上取沙蟹、辣椒、盐混合，放入多功能料理机中速粉碎3 min，加入菌种与蒸馏水500 g，然后放入均质机以6000 r/min均质10 min，放入恒温培养箱中发酵，按2 d/次的频率搅拌，发酵结束后成品即为微生物发酵法制备鲜辣沙蟹汁。

1.2.1.4 上清液制备

将成品鲜辣沙蟹汁搅拌均匀，并于5500 r/min条件下离心10 min，取上清液保存于-20 ℃备用。

1.2.2 单因素实验

在预实验基础上确定微生物发酵法制备鲜辣沙蟹汁的基础工艺条件及配方：发酵时间18 d，发酵温度28 ℃，复合发酵剂添加量30 mL，沙蟹1000 g，辣椒300 g，盐300 g。固定沙蟹1000 g的量不变，改变其他因素，以感官评价和氨基酸态氮含量为指标进行单因素实验。各因素变量值分别为：发酵时间12，14，16，18，20，22，24 d，发酵温度25，26，27，28，29，30，31 ℃，复合发酵剂接种量24，26，28，30，32，34，36 mL，辣椒添加量200，240，280，320，360，400，440 g，盐添加量240，260，280，300，320，340，360 g；鲜辣沙蟹汁制备结束后，样品冷却备用。

1.2.3 正交实验优化最佳工艺

在单因素实验基础上确定发酵时间、发酵温度、复合发酵剂添加量、辣椒添加量、盐添加量5个因素为自变量，每个因素取最佳的3个水平，以感官评分为正交实验指标，通过L9(35)实验确定最佳工艺配方，具体因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.4 感官评价

参考李锐等[6]的方法。挑选10名具有食品相关专业背景的感官评价员，其中5名男性，5名女性，年龄在20～25岁。感官评价采用感官描述法对鲜辣沙蟹汁进行感官属性分析，在鉴定前对评价人员进行培训。样品经水浴加热至45 ℃，随机取样进行感官评价，分别从色泽、气味、滋味和组织状态方面进行评价，取平均分为最终结果，具体感官评定标准见表2。

表2 感官评定标准Table 2 The sensory evaluation criteria

1.2.5 其他理化指标的测定

氨基酸态氮含量的测定参考张一江等[7]的方法，采用甲醛滴定法；挥发性盐基氮(TVB-N)的测定参考李鑫星等[8]的方法，采用半微量定氮法；游离氨基酸含量的测定采用GB 5009.124-2016的方法。

1.3 数据处理

实验结果用平均值±标准偏差表示(n=3)，使用Excel 2010和IBM SPSS 22.0软件进行作图和数据分析[9]。

2 结果与分析

2.1 复合发酵菌种比例的确定

氨基酸态氮是检验发酵类食品发酵程度的重要指标，鲜辣沙蟹汁在发酵过程中，蛋白质会被分解产生氨基酸等含氮化合物，其浓度是影响滋味的重要因素[10]。在文献研究的基础上，分别添加1%～6%的植物乳杆菌和鲁氏酵母菌进行发酵，由图1和图2可知，植物乳杆菌接种量在4%时，其氨基酸态氮含量最高；鲁氏酵母菌接种量在5%时，其氨基酸态氮含量最高，结合两种发酵菌最适合接种量，最终确定菌种混合比例为4∶5。

图1 植物乳杆菌对发酵过程中氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum on the content of amino acid nitrogen during fermentation

图2 鲁氏酵母菌对发酵过程中氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effect of Saccharomyces rougii on the content of amino acid nitrogen during fermentation

2.2 单因素实验

2.2.1 发酵时间对氨基酸态氮含量和感官评分的影响

鲜辣沙蟹汁在发酵过程中，发酵时间直接影响氨基酸态氮的含量，在发酵初期，受酶和微生物作用，蛋白质被分解，氨基酸态氮含量增加，当其趋于稳定说明基本分解完成，鲜辣沙蟹汁制备完成[11]。由图3可知，随着发酵时间延长，感官评分增加，在发酵第18天时，感官评分和氨基酸态氮含量均达到最大值，说明此时鲜辣沙蟹汁发酵已趋于成熟，继续发酵，受有机酸等次级代谢产物的影响使其品质下降。最终确定16，18，20 d作为正交实验数值。

图3 发酵时间对氨基酸态氮含量和感官评分的影响Fig.3 Effect of fermentation time on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.2.2 发酵温度对氨基酸态氮含量和感官评分的影响

菌种在发酵过程中受温度的影响较大，发酵温度过低，菌株代谢缓慢，不利于风味物质形成；温度过高，微生物代谢易被抑制，导致风味物质及氨基酸态氮含量下降[12]。由图4可知，发酵温度在29 ℃时氨基酸态氮含量与感官评分最高，因此发酵温度29 ℃较为适宜，综合分析选择28，29，30 ℃作为正交实验发酵温度。

图4 发酵温度对氨基酸态氮含量和感官评分的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.2.3 接种量对氨基酸态氮含量和感官评分的影响

发酵菌种接种量过低，发酵不充分，不利于风味物质的产生，接种量过高容易产生酵母味、酸味和酒精味，直接影响鲜辣沙蟹汁成品的品质[13]。由图5可知，随着接种量的增加，其感官评分和氨基酸态氮含量均呈先上升后下降的趋势，接种量为26 mL时品质最佳，最终确定24，26，28 mL 3个接种量作为正交实验数值。

图5 接种量对氨基酸态氮含量和感官评分的影响Fig.5 Effect of inoculation amount on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.2.4 辣椒添加量对氨基酸态氮含量和感官评分的影响

在其他发酵工艺恒定的前提下，分析不同辣椒添加量对鲜辣沙蟹汁发酵品质的影响。由图6可知，随着辣椒添加量的增加，氨基酸态氮变化幅度不明显，添加量为320 g时达到最大值，与感官评分标准一致。辣椒在鲜辣沙蟹汁中主要影响其辣度，过多或过少会出现成品辣味不足或过辣等问题，辣椒素对微生物有一定抑制作用，对发酵效果有一定影响。结合氨基酸态氮与感官评分结果，最终确定280，320，360 g 3种添加量作为正交实验数值。

图6 辣椒添加量对氨基酸态氮含量和感官评分的影响Fig.6 Effect of chili additive amount on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.2.5 盐添加量对氨基酸态氮含量和感官评分的影响

鲜辣沙蟹汁在发酵过程中，盐的添加能有效地抑制腐败微生物的繁殖，但是其也可以影响蛋白酶作用、氨基酸态氮的含量、成品的咸度[14]。由图7可知，随着盐添加量的增加，氨基酸态氮含量和感官评分先呈上升趋势，在320 g时达到最高值，说明随着盐添加量增加，盐有效地抑制了腐败微生物的繁殖，对氨基酸态氮含量的影响较小，但是随着盐添加量继续增加，氨基酸态氮含量和感官评分呈下降趋势。综合分析，盐的添加量选取300，320，340 g作为作为正交实验数值。

图7 盐添加量对氨基酸态氮含量和感官评分的影响Fig.7 Effect of salt additive amount on amino acid nitrogen content and sensory scores

2.3 正交实验优化鲜辣沙蟹汁的制备工艺

根据表3结合方差分析结果，以氨基酸态氮为指标的正交实验结果表明发酵时间和盐的添加量对鲜辣沙蟹汁的影响极显著(P<0.01)，发酵温度和接种量对其有显著影响(P<0.05)，即RA>RE>RD>RC>RB，最佳配方为A2B2C2D3E3；以感官评分为指标的正交实验结果表明发酵时间对鲜辣沙蟹汁的影响极显著(P<0.01)，接种量、辣椒添加量和盐添加量对其有显著影响(P<0.05)，即RA>RE>RC>RD>RB，最佳配方为A2B2C2D3E3；两个正交实验指标最佳配方一致，最终确定微生物发酵法制备的鲜辣沙蟹汁的最佳配方为A2B2C2D3E3，即以沙蟹添加量1000 g为基础，发酵时间18 d，发酵温度29 ℃，接种量26 mL，辣椒360 g，盐340 g。

表3 正交实验表

表4 正交实验结果分析表Table 4 The orthogonal test results analysis table

表5 方差分析Table 5 The analysis of variance

2.4 微生物发酵法与传统方法制备鲜辣沙蟹汁品质比较

2.4.1 感官评分、氨基酸态氮和挥发性盐基氮的含量比较

由图8可知，微生物发酵法制备的鲜辣沙蟹汁感官评分为94.12，与传统发酵法相比增加了6.53%；微生物发酵法制备的鲜辣沙蟹汁氨基酸态氮和挥发性盐基氮含量分别为8.89，1.05 mg/mL，与传统发酵法制备的鲜辣沙蟹汁相比，氨基酸态氮含量增加了9.48%，挥发性盐基氮含量下降了22.22%。感官评分为消费者直接的感官感受，其评分增加了6.53%，说明微生物发酵法制备的鲜辣沙蟹汁品质有效地提高了发酵品质。发酵菌种中的植物乳杆菌和鲁氏酵母菌在发酵过程中可以将大分子蛋白转化为小分子肽和氨基酸等鲜味物质，使鲜辣沙蟹汁的风味更加鲜美。挥发性盐基氮的下降说明在发酵过程中复合发酵剂能使鲜辣沙蟹汁中的有机酸含量增加，对腐败微生物生长有一定的抑制作用。综合分析，微生物发酵法与传统发酵法制备的鲜辣沙蟹汁在感官评分及氨基酸态氮和挥发性盐基氮含量等方面均具有优势，能有效地改善成品的品质。

图8 两种发酵法的感官评分及氨基酸态氮和挥发性盐基氮含量Fig.8 The sensory scores and content of amino acid nitrogen and TVB-N of two fermentation methods

2.4.2 游离氨基酸含量比较

鲜辣沙蟹汁鲜味的主要来源为游离氨基酸，其含量是判断成品品质的重要指标[15]。由表6可知，传统发酵法制备的鲜辣沙蟹汁中游离氨基酸总量为2609.85 mg/100 g，鲜味氨基酸含量为481.69 mg/100 g，甜味氨基酸含量为164.71 mg/100 g，鲜味与甜味氨基酸含量占总量的24.76%。微生物发酵法制备的鲜辣沙蟹汁游离氨基酸总量和鲜味与甜味氨基酸含量分别增加了12.98%和44.09%；结合文献分析，发酵菌种中的植物乳杆菌和鲁氏酵母菌有效丰富了氨基酸的种类和含量，有效提高了产品中游离氨基酸的含量，使成品的感官评分和风味更优。综合分析，鲜辣沙蟹汁添加发酵菌种后，游离氨基酸总量和鲜味、甜味氨基酸含量有显著增加，提高了鲜辣沙蟹汁的风味品质。

表6 两种发酵法的游离氨基酸含量

3 结论

通过单因素实验结合正交实验确定了鲜辣沙蟹汁的最佳工艺条件及配方为：发酵时间为18 d，发酵温度为29 ℃，沙蟹添加量为1000 g，植物乳杆菌和鲁氏酵母菌的最佳混合浓度比例为4∶5，接种量为26 mL，辣椒为360 g，盐为340 g，在此工艺及配方条件下制备的鲜辣沙蟹汁感官评分为94.12，氨基酸态氮含量为8.89 mg/mL。

通过对比分析传统发酵法与微生物发酵法制备鲜辣沙蟹汁的感官评价和理化指标，结果表明，微生物发酵法与传统发酵法制备的鲜辣沙蟹汁相比，感官评分增加了6.53%，氨基酸态氮含量增加了9.48%，挥发性盐基氮含量下降了22.22%，游离氨基酸总量增加了12.98%，鲜味与甜味氨基酸含量增加了44.09%。综合分析，微生物发酵法通过添加植物乳杆菌和鲁氏酵母菌显著提高了传统鲜辣沙蟹汁的风味品质，研究成果对于鲜辣沙蟹汁的工业化生产具有重要的实际意义，也为相关研究提供了参考依据。