响应面优化离子液体超声辅助提取黄花菜总黄酮工艺研究

张腊腊，胡浩斌，韩明虎，杨会玲

(陇东学院 化学化工学院，甘肃 庆阳 745000)

黄花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)是百合科萱草属草本植物的花[1-2]，属于典型的药食同源食疗食品。黄花菜含有丰富的营养[3]及药用价值[4-5]，研究表明黄花菜具有消肿、止血、抗菌、抗抑郁等功效，黄花菜中的黄酮是其抗抑郁的主要活性成分[6]，而且黄酮还是食品、调味品的生产原料[7-8]，所以从黄花菜中提取黄酮一直是研究热点。黄花菜中黄酮提取的传统方法有乙醇浸提法、超声辅助提取法、乙醇回流法、微波提取法等[9-10]。

传统提取方法普遍存在溶剂用量大、提取时间长、提取效率较低的问题。离子液体作为一种绿色环保型溶剂，因为其自身的特点在提取天然产物中的活性物质方面已经有很广泛的应用[11-13]。在黄酮类化合物提取中已经有离子液体在红花[14]、银杏[15]、葛根[16]、香叶总黄酮[17]等提取中的报道。采用离子液体从黄花菜中提取黄花菜黄酮尚未见文献报道。研究拟采用离子液体作为提取溶剂提取黄花菜中总黄酮，用响应面法对工艺条件进行优化，以期解决传统方法中有机溶剂用量过大及提取效率过低的问题，为黄花菜高附加值的生产提供有力的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄花菜：摘自甘肃庆阳庆城县；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(均为分析纯)：购自天津市北联精细化学品开发有限公司；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；芦丁标准品、离子液体[C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl(均为分析纯)：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

7230G型分光光度计 上海精密科学有限责任公司；SHB-3A型循环水式多用真空泵 郑州杜甫仪器厂；SB-5200DT型超声波清洗机 宁波新芝科技有限责任公司；YP20002型电子天平 上海横际科学仪器有限公司；FZ102型微型植物试样粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

精确称取芦丁对照品10 mg，加入75%乙醇使其完全溶解，定容至100 mL容量瓶中，得到浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。用移液管分别吸取芦丁标准溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 mL于5支25 mL容量瓶中，加入1 mL的5%亚硝酸钠溶液，立即摇匀，静置6 min；加入1 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀；6 min后加入10 mL的4%氢氧化钠溶液，摇匀，再放置等待6 min；最后用75%的乙醇溶液定容至25 mL，摇匀放置20 min。以不加芦丁标准溶液为空白组，使用分光光度计在波长为510 nm处测定不同浓度下的吸光度，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线[18]，进行线性回归所得回归方程为Y=1.0086X-0.0024(R2=0.9996)，说明黄花菜总黄酮含量与吸光度值在0～0.3 g/L范围内线性关系良好。

1.3.2 黄酮的提取及提取率的计算

黄花菜蒸熟晒干后用植物粉碎机粉碎待用。按照试验所需料液比加入不同体积、不同浓度的离子液体水溶液，在试验温度下超声提取一定时间后过滤，所得滤液中上清液作为黄花菜总黄酮提取液。吸取总黄酮提取液2.5 mL置于25 mL容量瓶中，按1.3.1标准曲线制作方法测定其在510 nm波长处的吸光度，根据标准曲线方程计算提取液中黄酮浓度C，并由下式计算出总黄酮得率:

式中：w为样品液中黄酮的浓度(mg/mL)；C为样品吸光度；V0为取样体积(mL)；V1为稀释体积(mL)；V2为样品溶液体积(mL)；m为样品质量(g)。

1.3.3 单因素试验设计

黄花菜烘干粉碎过70目筛，分别称取1.0 g黄花菜粉末平行5组，考察离子液体种类([C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl)、离子液体浓度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL)、提取温度(40，50，60，70，80 ℃)、提取时间(15，30，45，60，75 min)对总黄酮得率的影响。

1.3.4 响应面试验设计

采用Design-Expert 8.0.6 根据Box-Behnken中心组合设计试验原理，以离子液体浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取温度(D)为因素，以黄花菜总黄酮提取率为响应值，进行响应面分析试验，确定最佳提取工艺。

表1 响应面因素水平表

2 结果与讨论

2.1 离子液体种类的选择

由图1可知，随着碳链长度的增加，黄花菜总黄酮得率增大，但是溴盐要比氯盐得率高，这是因为Br-能与黄酮之间形成较强π-π相互作用和氢键相互作用，有利于黄酮的提取；碳原子数超过6以后，溴盐和氯盐黄酮的产率均开始下降，因为随着碳原子数的增多，导致空间位阻增大，增加了总黄酮的溶出阻力，因此确定[C6mim]Br作为提取溶剂。

图1 离子液体种类影响结果Fig.1 The effect of types of ionic liquids on the extraction rate of total flavonoids

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 离子液体浓度对总黄酮提取的影响

由图2可知，黄花菜总黄酮提取率随着[C6mim]Br浓度的升加呈现先升后降的趋势，这是因为离子液体浓度升高，其黏度会随之增大，提取溶剂的黏度太大会阻碍总黄酮的溶出，而且溶剂渗透进黄花菜的能力也会下降，所以确定[C6mim]的浓度为0.8 mol/L。

图2 离子液体浓度影响结果Fig.2 The effect of content of ionic liquid on the extraction rate of total flavonoids

2.2.2 料液比对总黄酮提取的影响

由图3可知，在料液比为1∶15之前，随着料液比的增大，黄花菜总黄酮提取率增大，料液比在1∶15时达到最大，随后开始降低。因为料液比较低时，溶剂量较少，总黄酮和提取溶剂浓度差较大，增大了总黄酮溶出的势差，利于黄酮的提取，随着料液比的继续增加，溶剂的渗透压增大，会导致其他杂质溶出，黄酮的提取率下降，所以选择料液比为1∶15(g/mL)。

图3 料液比影响结果Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 提取温度对总黄酮提取的影响

由图4可知，黄花菜总黄酮提取率在提取温度为70 ℃ 时达到最大值，温度低于或超过70 ℃，总黄酮得率都呈现下降趋势。呈现这种趋势是因为在温度小于70 ℃时，升高温度和超声波起到了协同加和的效果，所以总黄酮提取率随着温度的升高而增大，温度超过70 ℃后，总黄酮的结构可能由于高温受到损坏，导致提取率开始下降，确定试验温度为70 ℃。

图4 提取温度影响结果Fig.4 The effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.2.4 提取时间对总黄酮提取的影响

提取时间对总黄酮提取率的影响见图5。

由图5可知，30 min之前黄酮提取率随着时间的延伸增加比较缓慢，30 min后提取率增加比较显著，45 min时总黄酮提取率达到最大值，之后又开始下降。这是因为离子液体提取黄酮的原理是它可以与植物细胞壁中的纤维素形成氢键，破坏纤维素的结构，将黄酮大量溶出。刚开始提取由于时间太短，离子液体没有充分渗透进黄花菜组织，所以总黄酮溶出量较低，而随着时间的延伸，黄花菜中总黄酮基本上完全被提取，时间继续延长，离子液体可能会与其他物质的纤维素作用，导致非黄酮类物质溶出，总黄酮的得率下降。因此最终确定试验时间为45 min。

图5 提取时间影响结果Fig.5 The effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验结果

响应面试验分析结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 The experiment results of RSM

2.3.2 响应面模型与分析

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2中试验数据进行二次回归分析，可以得到以下数学模型：

R1=14.93+1.67A-1.30B+0.78C+3.58D-0.33AB+1.94AC+1.98AD-0.42BC+2.08BD-1.03CD-5.32A2+1.81B2+0.92C2+0.7D2。

各因素的方差分析结果见表3。

表3 离子液体提取黄花菜总黄酮回归模型方差分析Table 3 The variance analysis for the regression model of ionic liquid extraction of total flavonoids from Hemerocallis citrina

续 表

由表3可知，本试验模型“P>F”值小于0.01，二次方程拟合极显著，说明本次试验方法可靠，可以用来分析和预测离子液体对黄花菜总黄酮提取的效果。一次项中提取温度的“P>F”值小于0.01，因此它对提取率的影响极显著，离子液体浓度的“P>F”值小于0.05，说明离子液体浓度对黄花菜总黄酮提取率的影响显著，而B和C的“P>F”值均大于0.05，说明料液比和浸提时间对黄花菜总黄酮提取率的影响不显著；二次项中A2的P>F”值小于0.01，B2的“P>F”值小于0.05，C2、D2的“P>F”值均大于0.05，所以二次项对总黄酮提取率的影响大小依次为A2>B2>C2>D2。

由图6可知，各因素之间的交互作用对响应值的影响结果为：离子液体浓度与料液比的交互作用等高线呈椭圆形，当料液比较小时，离子液体浓度对黄花菜总黄酮提取率的影响显著，表现在图上为曲线较陡，说明在料液比较小的范围内增加离子液体浓度，总黄酮提取率有明显的升高；当料液比增大时，曲线开始变得平缓，说明料液比较大时增加离子液体浓度，总黄酮提取率不再显著升高，说明这两个因素之间是互相制约的关系，这也符合二次回归方程中这两项系数为负的结果。

图6 因素交互作用响应面结果图Fig.6 The response surface plots and contour lines of interaction of various factors on the extraction rate of total flavonoids

2.4 验证试验

由回归模型预测得到[C6mim]Br提取黄花菜总黄酮的最佳条件：[C6mim]Br浓度为0.83 mol/L，料液比为1∶20(g/mL)，提取时间为30.02 min，提取温度为60.35 ℃，总黄酮提取率预测值为23.47%。为方便实际试验操作，修正条件为：离子液体浓度0.8 mol/L、料液比1∶20(g/mL)、提取时间30 min、提取温度60 ℃。 在此条件下进行重复试验，重复试验值为23.30%，与预测值相对误差为0.72%，说明此方法所得工艺参数可靠。

3 结论

采用[C6mim]Br提取黄花菜总黄酮的最佳工艺条件为：[C6mim]Br水溶液浓度0.8 mol/L，料液比1∶20(g/mL)，提取时间30 min，提取温度60 ℃，在此条件下黄花菜总黄酮提取率为23.30%，与传统有机溶剂提取工艺(提取率0.581%[18])相比，黄花菜总黄酮提取率有了大幅提高。上述试验结论为黄花菜黄酮在食品、药品、功能型调味品方面的应用提供了理论依据，可以提高黄花菜的附加价值。