枇杷-梨复合果醋发酵工艺的研究

孟金明，刘秋鸣，熊思敏，张霞，吴娜

(红河学院 理学院，云南 蒙自 661100)

枇杷果肉软而多汁，具有独特的果香味，且含有人体所需的多种维生素以及矿物质元素[1]。梨是我国的三大水果之一，其中含有蛋白质、膳食纤维、有机酸、多种维生素和矿物质以及丰富的酚类物质[2-3]。果醋是主要以水果为原材料经过酒精发酵和醋酸发酵两次发酵工艺酿制而成的一种新型饮品，果醋不仅保留了水果原材料中很多营养成分，而且经过微生物的发酵作用产生了原材料中所不具有的多种功能性成分，因此果醋具有较好的保健功能[4]。随着人们生活水平的不断提高，传统模式的食品逐渐开始淡出人们的视野，如今人们更加注重食物的营养性和健康性[5-7]。目前国内利用水果及蔬菜等原料进行果醋酿造的研究也越来越多，而对于枇杷和贡梨的研究主要集中在保鲜等方面[8-9]。本试验以贡梨和蒙自长虹枇杷为原料，酿制风味独特、果香浓郁、酸甜爽口的果醋产品，不仅可以解决水果资源因不易贮藏和保鲜造成的浪费问题，而且为枇杷和贡梨的深加工产业提供了理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试材料为蒙自长虹枇杷和市售贡梨。纤维素酶(80000 U/g)、果胶酶(80000 U/g)、焦亚硫酸钾、柠檬酸：友谊食品添加剂公司；安琪果酒酵母：安琪酵母有限公司；醋酸菌：上海迪发酿造生物制品有限公司；食用酒精：河南河阳酒精实业有限公司；维生素C、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、碳酸氢钾：均为分析纯(AR)，国药集团化学试剂有限公司；试验室用水均使用蒸馏水。

GSP-9160MBE型隔水式恒温培养箱 上海博讯实业有限公司；MQW-63G型恒温振荡培养箱 上海旻泉仪器有限公司；CP224C型电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海雷磁仪器有限公司；LB90A手持糖度计 广州市铭睿电子科技有限公司；JYL-Y15型九阳高速破壁调理机 九阳股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 枇杷-梨复合果醋的发酵工艺流程

①枇杷：挑选枇杷→清洗→热烫→去皮、去核→护色液浸泡→打浆。
②梨：挑选梨→清洗→去皮、切块→护色液浸泡→打浆。
活性干酵母→活化→酵母活化液
↓
①+②按比例混合→酶解→二氧化硫处理→成分调整→接种→
酒精发酵→过滤→成分调整→接种→醋酸发酵→测定。
↑
醋酸菌活化液←活化和扩大培养←醋酸菌

1.2.2 工艺流程中的操作要点

1.2.2.1 原料挑选与前处理

挑选出成熟度良好、外表无明显机械损伤的枇杷，取适量放入沸水中热烫20～30 s，热烫后放入冷水中，去除果皮和果核，将果肉放入含有0.15%柠檬酸和0.05%维生素C的护色液中浸泡10 min，取出果肉，加入0.1%维生素C放入榨汁机中打浆。挑选中等大小的、无腐烂或变质的贡梨，去皮，将果肉切成小块放入护色液中浸泡10 min，取出果肉，加入0.05%维生素C放入榨汁机中打浆。

1.2.2.2 枇杷-梨复合果醋酒精发酵条件的确定

通过前期试验确定枇杷-梨复合果醋酒精发酵阶段的条件：枇杷汁与贡梨汁的比例为1∶2(V/V)，初始pH为4.6，SO2添加量为61 mg/L，发酵温度为22 ℃，初始糖度为21%，酵母添加量为0.2%，在以上条件下发酵所得枇杷-梨复合果醋具有较好的风味、色泽和酒精度。

1.2.2.3 醋酸菌活化

种子培养基的配比：1.5 g葡萄糖、1 g酵母膏、2 g碳酸钙和100 mL蒸馏水。培养基灭菌后，冷却至室温，在无菌条件下向每瓶培养基中加入2.1 mL食用酒精和1.05 g醋酸菌，最后放入振荡培养箱中，培养温度为31 ℃，转速为180 r/min，培养72 h。种子液经3 d培养至酸度值达到2.4 g/dL以上时即可使用，将调整成分后的果酒分装入250 mL锥形瓶中，在无菌条件下接入醋酸菌种子液，用4层纱布封口后放入振荡培养箱中，调整发酵温度和转速进行发酵。

1.2.3 理化成分测定

醋酸的测定：采用电位滴定法[10]。

1.2.4 枇杷-梨复合果醋发酵单因素试验

1.2.4.1 枇杷-梨复合果醋发酵时间的确定

调整发酵液的初始酒精度为8% vol，将70 mL果酒液装入250 mL三角瓶中，然后接入7%的醋酸菌，置于31 ℃下，分别在发酵第3，5，7，9，11天测定其酸度值，分析果醋酸度值随发酵时间变化的规律，确定醋酸发酵的最佳时间。

1.2.4.2 枇杷-梨复合果醋醋酸菌接种量的确定

调整发酵液的初始酒精度为8% vol，将70 mL发酵液装入250 mL锥形瓶中，分别接入3%、5%、7%、9%、11%的醋酸菌接种量，置于31 ℃下，发酵9 d，分别测定其酸度值，分析果醋酸度值随醋酸菌接种量变化的规律，确定最优的醋酸菌接种量。

1.2.4.3 枇杷-梨复合果醋装液量的确定

调整发酵液的初始酒精度为8% vol，分别将60，70，80，90，100 mL发酵液装入250 mL锥形瓶中，醋酸菌接种量为7%，置于31 ℃下，发酵9 d，分别测定其酸度值，分析果醋酸度值随装液量变化的规律，确定最优的装液量。

1.2.4.4 枇杷-梨复合果醋初始酒精度的确定

分别调整发酵液的初始酒精度为5% vol、6% vol、7% vol、8% vol、9% vol，将70 mL发酵液装入250 mL锥形瓶中，醋酸菌接种量为7%，置于31 ℃下，发酵9 d，分别测定其酸度值，分析初始酒精度对果醋酸度的影响，确定果醋发酵的初始酒精度。

1.2.4.5 枇杷-梨复合果醋发酵温度的确定

调整发酵液的初始酒精度为8% vol，将70 mL发酵液装入250 mL锥形瓶中，醋酸菌接种量为7%，分别置于27，29，31，33，35 ℃下，发酵9 d，分别测定其酸度值，分析发酵温度对果醋酸度的影响，确定果醋发酵的最佳发酵温度。

1.2.5 枇杷-梨复合果醋发酵条件响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，选取发酵温度(A)、接种量(B)和初始酒精度(C)3个因素为自变量，以酸度值(Y)作为响应值，采用三因素三水平的响应面分析方法对复合果醋的发酵工艺条件进行优化，试验因素水平设计见表1。

表1 响应面分析试验因素水平及编码表

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 枇杷-梨复合果醋发酵条件的单因素试验

2.1.1 不同发酵时间对枇杷-梨复合果醋酸度的影响

由图1可知，发酵3 d后果醋的总酸度就达到了35 g/L左右，因为枇杷-梨复合果醋酒精发酵阶段结束后的发酵液具有一定的酸度，再加上接入的醋酸菌种子液也有一定的酸度，因此会造成发酵液的初始酸度较高。从发酵的第3天到第5天醋酸菌大量繁殖，消耗发酵液的乙醇大量合成醋酸，使得发酵液的总酸含量迅速上升；当发酵5 d以后，随着发酵液中乙醇、糖类等营养物质的减少，醋酸菌的醋酸代谢减缓，进而发酵液的总酸含量上升的速度变缓；当发酵时间在9 d之后，发酵液的总酸基本趋于平稳，发酵液的总酸含量达到51.27 g/L，这时发酵液中的营养物质基本消耗殆尽而且酸度很高，醋酸菌的醋酸发酵基本结束[11]。因为醋酸发酵过程在9 d基本结束，总酸含量也已经达到40 g/L以上，综合时间成本，因此选择枇杷-梨复合果醋的醋酸发酵时间为9 d。

图1 发酵时间对枇杷-梨复合果醋酸度的影响Fig.1 Effect of fermentation time on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.2 不同醋酸菌接种量对枇杷-梨复合果醋酸度的影响

由图2可知，当醋酸菌的接种量处于一个较低的水平3%时，导致醋酸菌在发酵液中的总量偏少，不具备较好的产酸能力，导致发酵液中的酒精不能尽快地转化为醋酸，而且会使果醋发酵的周期延长，增大发酵染菌的几率。当醋酸菌的接种量为3%～7%时，复合果醋的酸度随着接种量的增加而呈现大幅度上升的趋势，接种量为7%时果醋的酸度达最高值，为51.15 g/L，然而当接种量大于7%后，醋酸菌的生长繁殖明显增快，发酵液中醋酸菌数量的激增，一方面会消耗过多的营养成分，另一方面会过早地进入衰亡期，大量菌体老化以及自溶，从而影响醋酸发酵过程，果醋的酸度呈现缓慢下降的趋势[12]。通过显著性分析可以看出，接种量为7%与其他几个处理组的酸度值均具有显著性差异(P<0.05)，因此选取复合果醋发酵的最适醋酸菌接种量为7%。

图2 醋酸菌接种量对枇杷-梨复合果醋酸度的影响Fig.2 Effect of acetic acid bacteria inoculation amount on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.3 不同装液量对枇杷-梨复合果醋酸度的影响

由图3可知，复合果醋的酸度值随着发酵液装液量的升高而呈现下降的趋势。因为本试验使用250 mL锥形瓶进行果醋发酵，随着发酵液装液量的增多，锥形瓶中的空气柱越小，因此导致发酵液的含氧量降低，从而影响醋酸菌的生长繁殖，由于复合果醋的醋酸发酵过程是振荡培养，因此装液量过高还会导致发酵液污染封口的纱布，使得发酵液受杂菌污染的几率增加[13]。当装液量为100 mL时发酵所得的果醋酸度值最低，装液量为60 mL和70 mL时酸度值在52 g/L左右，两者差异不显著(P>0.05)；但由于60 mL的装液量到发酵结束后发酵液会有少量损失，不利于对其进行酸度值的检测，并且在酸度值相似的情况下，70 mL的装液量可以提高果醋的生产率，因此选取70 mL为果醋发酵最适的装液量。

图3 装液量对枇杷-梨复合果醋酸度的影响Fig.3 Effect of liquid loading volume on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.4 不同初始酒精度对枇杷-梨复合果醋酸度的影响

在复合果醋发酵阶段，醋酸菌将会利用果酒中的乙醇和残糖等营养物质来进行醋酸的代谢，所以初始发酵液中的乙醇含量直接影响发酵液中醋酸菌的产酸量[14]。由图4可知，果醋的酸度值随着初始酒精度的增大呈先升高后降低的趋势，当初始酒精度为7% vol时，发酵液的酸度值达到最高53.24 g/L，随着初始酒精度的继续升高，酸度值反而呈现下降的趋势，因为初始发酵液中的乙醇过多会降低醋酸菌的代谢活力，不利于醋酸菌的生长，使得发酵液中醋酸菌的数量不能在短时间内达到要求，从而导致整个发酵周期的延长，在发酵结束时复合果酸的酸度值偏低[15]。通过显著性分析可以得出，初始酒精度为7% vol与其他几个处理组的酸度值均具有显著性差异(P<0.05)，所以选取最佳的初始酒精度为7% vol。

图4 初始酒精度对枇杷-梨复合果醋酸度的影响Fig.4 Effect of initial alcohol degree on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.1.5 不同发酵温度对枇杷-梨复合果醋酸度的影响

温度对醋酸菌的生长有着重要的影响，温度过高或过低都会对醋酸菌体内酶的活性造成影响，从而影响醋酸菌的醋酸代谢，而且不同的醋酸菌最适的发酵温度也不尽相同[16]。由图5可知，当发酵温度为27 ℃时，醋酸菌的生长十分缓慢，发酵液的菌体数量偏低，从而导致复合果醋的酸度值较低；随着发酵温度的升高，所得果醋的酸度值不断升高，并在31 ℃时达到最大值52 g/L。当发酵温度高于31 ℃之后，醋酸菌的产酸量又呈现下降趋势，因为发酵温度较高时醋酸菌大量增殖，发酵会过早进入衰亡期，菌体大量老化以及自溶，使得所得复合果醋的酸度值偏低[17]。通过显著性分析可以得出，发酵温度为31 ℃与其他几个处理组的酸度值均具有显著性差异(P<0.05)，所以选择发酵温度为31 ℃最佳。

图5 发酵温度对枇杷-梨复合果醋酸度的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on the acidity value of loquat-pear compound fruit vinegar

2.2 枇杷-梨复合果醋发酵条件响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计及结果

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上选取对复合果醋发酵影响较大的因素发酵温度(A)、接种量(B)和初始酒精度(C)作为考察因素，以果醋酸度值作为响应值 (Y) ，设计三因素三水平的响应面优化试验，响应面试验结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果Table 2 The results of Box-Behnken central composite design

2.2.2 响应面回归方程模型的建立及方差分析

使用Design-Expert 10软件对表2中得到的试验结果进行多元线性回归拟合，可以得到枇杷-梨复合果醋的酸度(Y)对应醋酸发酵中发酵温度(A)、接种量(B)和初始酒精度(C)的回归方程模型为：Y=53.46-1.34A+1.53B+0.83C-0.98AB-1.63AC-0.62BC-3.24A2-3.92B2-2.76C2，方程中Y为酸度，A、B、C分别表示3个影响因素各自对应的编码值。对枇杷-梨复合果醋的试验结果进行回归方程模型的方差显著性检验，结果见表3。

表3 回归方程模型的方差和显著性分析Table 3 The variance and significance analysis of regression equation model

续 表

由表3可知，本试验中模型的P值<0.0001，极显著；失拟项的P值为0.8457，不显著，可得出试验所得模型拟合性较好，该模型中各个影响因素的相关系数R2为0.9931，说明该模型能够对实际试验中99%以上的响应值做出解释，因此本模型适用于分析和预测枇杷-梨复合果醋的发酵工艺条件。由表3中还可以得出自变量一次项A、B、C均具有极显著差异(P<0.01)；交互项中，AB、AC有极显著差异(P<0.01)，BC具有显著差异(P<0.05)，模型交互效应影响显著；二次项系数A2、B2、C2的P值均<0.0001，模型的曲面效应极显著[18]。根据F值的大小可得出各发酵工艺因素对枇杷-梨复合果醋的酸度值的影响大小为：醋酸菌接种量(B)>发酵温度(A)>初始酒精度(C)。

2.2.3 试验因素的交互作用分析

从Design-Expert 10响应面分析软件中得到的两两因素间的三维曲线图和等高线图见图6～图8。根据这3个因素对酸度值所形成的三维曲线图可以较好地反映出发酵温度、初始酒精度和接种量这3个因素之间的交互作用对枇杷-梨复合果醋酸度的影响情况，曲面的倾斜程度越大则说明此因素对果醋酸度值的影响越大。等高线图中图形的形状可以反映出各因素之间交互作用的显著程度，图形为椭圆形则表示两个因素的交互作用显著[19-20]。

由图6可知，发酵温度和接种量交互形成的曲面坡度较大，说明其对酸度的影响较大，其等高线图近似椭圆形，说明交互作用较显著；由图7可知，发酵温度和初始酒精度交互形成的曲面坡度陡峭，说明其对酒精度的影响较大，并且等高线图呈椭圆形，说明两者的交互作用极显著；由图8可知，接种量和初始酒精度交互形成的曲面坡度较大，而且等高线图呈椭圆形，说明这两个因素的交互作用比较显著。

图6 发酵温度和接种量交互影响酸度的响应面图和等高线图Fig.6 The response surface and contour plot of the effect of fermentation temperature and acetic acid bacteria inoculation amount interaction on the acidity value

图7 发酵温度和初始酒精度交互影响酸度的响应面图和等高线图Fig.7 The response surface and contour plot of the effect of fermentation temperature and initial alcohol degree interaction on the acidity value

图8 接种量和初始酒精度交互影响酸度的响应面图和等高线图Fig.8 The response surface and contour plot of the effect of acetic acid bacteria inoculation amount and initial alcohol degree interaction on the acidity value

2.2.4 最佳发酵条件的预测与检验

通过响应面分析试验可得出枇杷-梨复合果醋的最佳发酵参数：温度为32.103 ℃，接种量为7.258%，初始酒精度为6.973% vol，此预测条件下可得到果醋酸度为51.792 g/L。根据实际可操作性，将发酵温度调整为32 ℃，接种量调整为7.3%，初始酒精度调整为7% vol，结合单因素试验结果再将发酵时间设定为9 d、装液量设定为70 mL进行响应面验证试验。在此条件下发酵所得复合果醋的酸度值为51.65 g/L，实际值与理论值相差较小，用此模型进行试验设计和数学模型具有可靠性。

3 结论

采用单因素试验和响应面分析试验，对枇杷-梨复合果醋醋酸发酵过程中主要发酵条件进行优化，得出对复合果醋酸度影响最大的是醋酸菌接种量，其次是发酵温度，而初始酒精度的影响最小；枇杷-梨复合果醋醋酸阶段的最佳发酵工艺条件为：发酵温度为32 ℃，接种量为7.3%，初始酒精度为7% vol。在此最优条件下复合果醋的酸度为51.65 g/L，所得果醋呈淡黄色，澄清透明，果香浓郁，口感醇厚。枇杷-梨复合果醋的研制不仅可以解决枇杷和贡梨在鲜果销售过程中的腐败浪费，而且可以为枇杷和贡梨的深加工工艺提供理论依据，提高农产品的附加价值，推动果醋产业的发展。