市售调味酱中5种真菌毒素的测定

蒋孟圆，陈俊秀，农蕊瑜，申颖，李洁，胡琳，李文廷*

(1.云南民族大学 民族医药学院，昆明 650500；2.昆明市疾病预防控制中心，昆明 650228)

芝麻酱和花生酱具有丰富的植物蛋白、维生素和矿物质,是大众消费者普遍喜爱的香味调味品[1-2]。出于消费者口味的考量，商家会加入风味独特如板栗等上乘的食材，也有商家为了博取丰厚的利润而添加大豆、玉米等廉价原材料[3-5]，另外不同的加工方式对芝麻酱和花生酱的粒径和稳定性均有不同影响，在储存过程中，容易出现析油分层现象，对品质保障具有一定的影响[6]。然而，由于原材料或者添加的辅料本身在种植、储藏、转运过程中以及成品在储存售卖期间均可能受到霉菌的污染，给商家造成经济损失，给消费者的健康和食品安全形成严重威胁[7]。

黄曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是在湿热条件下主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)产生的次生代谢产物，主要有黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFTB1)、黄曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFTB2)、黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFTG1)和黄曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFTG2)，其中AFTB1的毒性最强，污染程度也最严重，黄曲霉毒素的毒性作用主要表现为严重破坏人及牲畜的肝脏组织，导致肝癌或死亡[8-10]。近乎50%的霉菌品种如赭曲霉菌、黑曲霉菌、青霉属等都能产生赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。OTA的危害主要表现为肾脏及肝脏毒性, 引起致突变、致癌和致畸[11]。各国都致力于严格监控这些毒素的含量，我国标准GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》[12]规定花生制品的AFTB1限值为20 μg/kg，其他制品为5.0 μg/kg，OTA限值为5.0 μg/kg。

目前5种真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法及高效液相色谱-串联质谱法[13-16]，酶联免疫法虽然校测效率高，但灵敏度和准确度较低。高效液相色谱法为常见的检测方法，但只能检测单一类毒素，对多毒素样品的测定需要较大时限。而高效液相色谱-串联质谱法的灵敏度、准确性及选择性都较高。由于近些年昆明市售芝麻酱和花生酱存在一定霉菌污染情况[17-18]，本文针对云南市售芝麻酱、花生酱和黄豆酱样品，通过优化样品前处理条件，采用内标法准确定量，建立5种真菌毒素同时检测的高效液相色谱-串联质谱法，为政府相关职能部门提供了技术及数据支持，保障了居民的食用及健康安全。

1 材料与方法

1.1 材料

检测样品由云南红河、曲靖、楚雄、大理和昆明5州市疾病预防控制中心进行采集提供，每个地方分别采集花生酱、芝麻酱和黄豆酱每类样品2件，共计30件。

1.2 仪器与试剂

1290 InfinityⅡ超高效液相色谱-串联质谱联用仪 美国Agilent Technologies公司；QTRAP 4500超高效液相色谱-串联质谱联用仪 美国AB SCIEX公司；XS205DU分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；3H16RI智能台式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司。

标准物质AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、OTA和同位素内标13C17-AFTB1、13C17-AFTB2、13C17-AFTG1、13C17-AFTG2、13C20-OTA(10.2 μg/mL)以及质控样MRM-AC-2909和MRM-AW-0211：均购于Pribolab中国公司；甲醇和乙腈：均为色谱纯，购于美国Sigma-Aldrich公司；质控样Lot#M15361A：购于Romer Labs公司。

1.3 色谱条件

色谱柱为Waters BEH C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm), 柱温为40 ℃, 流动相A相：甲醇∶乙腈混合体积比1∶1，B相：0.2%甲酸水溶液。流速为0.3 mL/min, 进样体积为10 μL, 分析运行时间为6.0 min。

1.4 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI)，采用正离子扫描模式，离子源温度为550 ℃；离子喷雾电压为5500 V；气帘气(curtain gas)为25 psi；雾化气(gas 1)为55 psi；辅助气(gas 2)为55 psi；多反应监测模式测定(MRM)。

1.5 实验方法

1.5.1 标准溶液配制

分别将5种标准物质用乙腈稀释至浓度为1.0 μg/mL储备液，同位素内标液用乙腈稀释为0.5 μg/mL工作液，再用乙腈水溶液(2∶8，体积比)配制标准系列，标准系列中每个溶液点内标含量均为1.0 μg/L，分别储存于-20 ℃条件下。

1.5.2 样品前处理

精确称取试样(2±0.01) g于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈-水-甲酸溶液(70∶29∶1，体积比)于多功能涡旋振荡器上提取30 min，离心机10000 r/min离心5 min，取10 mL上清液用氮吹浓缩至近干，加入同位素内标工作液，使样品中含量均为1.0 μg/L，乙腈水溶液(2∶8，体积比)定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜，用高效液相色谱-串联质谱测定分析。

2 结果与分析

2.1 检测模式的选择

通过对5种真菌毒素标准物质和同位素内标的母离子和子离子进行寻找，在相同浓度条件的检测中，负离子模式下响应强度为104左右，而正离子模式下响应强度可达106，并且AFTG2和OTA的子离子在负离子模式下较少分裂产生碎片离子峰，响应强度基本在103附近，在正离子模式下5种真菌毒素有较好的二级质谱碎片离子分裂情况，响应强度较明显，因此选择正离子模式测定分析样品。

2.2 色谱条件的优化

通过对流动相组成和配比进行考察，B相为纯水时目标峰的响应强度较低甚至未出现目标峰，加入甲酸后目标峰的响应强度有显著加强。A相为单一有机相时目标化合物的分离度较小，当为混合有机相时能达到较好的分离效果，目标化合物的总离子图见图1。因此确定了甲醇-乙腈按1∶1体积比混合为A相，0.2%甲酸水为B相，洗脱程序：0～1.0 min，60% B；1.0～2.0 min，60% B～30% B；2.0～3.0 min，30% B～0% B；3.0～3.5 min，0% B；3.5～4.5 min，0% B～30% B；4.5～5.5 min，30% B～60% B；5.5～6.0 min，60% B。

2.3 质谱条件的优化

依次将5种真菌毒素储备液及同位素内标工作液稀释至500.0 μg/L，在流动注射状态下，利用Q1 MS全扫描以及Product Ion Scan(MS2)碎片离子扫描模式分别进行各真菌毒素的一级、二级质谱碎片离子寻找，取响应程度较高的前2个碎片离子作为定量和定性离子, 通过仪器MRM扫描模式优化去簇电压及碰撞能量参数，详细参数见表1，在此条件下5种真菌毒素的总离子色谱图见图1，各真菌毒素的碎片离子MRM谱图见图2。

表1 5种真菌毒素及同位素内标的质谱参数Table 1 The mass spectrum parameters for five mycotoxins and isotope internal standard

图1 5种真菌毒素在10 μg/L浓度的总离子色谱图Fig.1 The TIC of five mycotoxins at 10 μg/L

图2 5种真菌毒素在10 μg/L浓度的MRM色谱图Fig.2 The MRM chromatograms of five mycotoxins at 10 μg/L

2.4 样品提取净化的优化

考察了不同提取溶剂对5种真菌毒素回收率及质控样测定值的影响，70%乙腈-水具有96%的提取效率，为所对比提取溶剂中最高值，加入1%的甲酸可以加强5种真菌毒素的稳定性，提高实验测定值的重现性。由于样品基质复杂情况不同，而免疫亲和柱对真菌毒素特异选择性不同，且对于基层实验室使用成本较高，采用物理吸附的多功能净化柱，可吸附大部分干扰杂质，操作步骤较为简单，很大程度上提高了样品的净化效率，通过同位素内标的定量可以满足实验室的检测要求。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系及检出限

通过上述优化的样品前处理条件和色谱及质谱条件，对样品进行真菌毒素的测定，以定量离子峰的峰面积为纵坐标、质量浓度(μg/L)为横坐标绘制标准曲线，在所检测的浓度范围内均具有良好的线性关系，相关系数均在0.9990以上。以3倍信噪比(S/N)对应的浓度为方法检出限，10倍信噪比对应的浓度为方法定量限，详细数据见表2。

表2 5种真菌毒素的线性关系、检测限

2.5.2 方法的回收率

选取花生酱基质样品进行加标回收实验，分别添加混合真菌毒素标准溶液至浓度为1.0，2.0，10.0 μg/kg，按照样品前处理条件进行处理并上机测定，每个添加浓度做6个平行实验，5种真菌毒素的平均回收率为87.1%～103.4%，并计算相对标准偏差(RSD)作为方法的精密度，结果为1.18%～5.26%，具体结果见表3。

表3 5种真菌毒素的加标回收率和精密度(n=6)

2.6 质量控制

分别精确称取3种真菌毒素质控样,依据样品前处理方法进行处理,检测结果均符合标准证书要求，结果见表4。

表4 准确度数据Table 4 The accuracy data μg/kg

样品的加标回收率、精密度以及质控样品的测定数据表明，芝麻酱、花生酱和黄豆酱样品按照此种方法提取净化分析，具有较高的提取效率，准确度较好。

2.7 样品检测分析

30件样品中，真菌毒素的检出情况根据样品种类存在明显的差异，花生酱样品中有4件检出AFTB1，检出率为40%，其中2件检测结果超过国家标准规定限值20 μg/kg，超标率为20%，2件检出AFTB2，检出率为20%，其他毒素未检出；芝麻酱样品中有1件检出AFTB1，且检测结果超过国家标准规定限值5.0 μg/kg，检出率和超标率均为10%，其他毒素未检出；黄豆酱样品中真菌毒素均未检出。从整批次样品统计来分析，5件检出AFTB1，检出率为16.7%；3件超标，超标率为10%；2件检出AFTB2，检出率为6.7%；其余均为未检出。云南市售芝麻酱和花生酱中真菌毒素的污染情况不容乐观，应引起相关政府职能部门的重视，检出情况见表5。

表5 真菌毒素含量检出详情Table 5 The detecting details of mycotoxins' content

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定芝麻酱、花生酱和黄豆酱中5种真菌毒素的检测方法，该方法的样品前处理简单、检测便捷，整个实验的灵敏度和准确度高，回收率好，可以满足日常监测工作对多种调味制品中5种真菌毒素的同时定性定量检测分析要求。