戊糖乳杆菌DF9对副溶血弧菌群体感应的淬灭作用

上官文丹，陈 可，陈清莹，张杏果，钟青萍,

（1.华农（潮州）食品研究院有限公司，广东潮州 521000；2.广东省食品质量与安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种常见的食源性病原菌，能导致水产动物或人的细菌性感染疾病甚至是死亡。生物被膜是指细菌菌体与胞外的蛋白质、多糖、DNA等相互粘连形成的膜样聚集体[1]，是细菌为适应复杂多变的生存环境而进化的高效策略。副溶血弧菌普遍具有较强的生物被膜形成能力，能在海鲜、食物接触表面以及食品加工设备表面上成膜[2]，扩大细菌对食品的污染范围，增加对宿主的感染的机率。统计资料表明，副溶血弧菌引起的食物中毒位居微生物食物中毒的首位，给全球食品安全和人类健康造成潜在的威胁[3-5]。

群体感应（quorum sensing，QS）是细菌集体行为的一种现象，细菌通过自诱导群体感应信号分子（autoinducer，AI）来感知环境中种群密度的变化，当细菌密度达到一定阈值时，就能调控细菌中某些基因的表达，进而表现为一系列的行为特征，包括毒力因子分泌、生物被膜形成、孢子形成、胞外水解酶和胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）产生等，实现单个细胞无法完成的群体性行为，提高细菌对不良环境的适应性，对致病菌的防治带来严峻的挑战[6]。QS是副溶血弧菌生活方式的一个重要特征[7]，其中LuxS/AI-2型QS调控系统介导细菌的致病性和抗逆性，是近年来的研究热点。张义全[8]和蒋富凤等[9]的研究结果表明，受QS系统中LuxM和LuxS分别调控的OpaR和AphA在副溶血弧菌的不同生长阶段调控副溶血弧菌的毒力因子表达和生物被膜形成等生理途径；GUO等[7]研究发现，副溶血性弧菌的生长、毒力及生物被膜形成受LuxM/LuxS依赖的QS系统所调控。

细菌的致病机制、抗性等主要生理功能依赖其QS系统的调节和控制，而且在食品腐败变质过程中QS系统也发挥重要作用[10]，因此干扰细菌的群体感应是目前研究的热点。QS抑制剂（quorum sensing inhibitors，QSIs）是一类能淬灭细菌QS系统的物质，其可干扰致病因子等基因的表达，降低致病性，但不引起细菌产生耐药性，因此QSIs有望成为控制食品腐败变质和减少食物中毒的有效策略。研究发现部分合成和天然的物质对病原菌具有潜在的抗QS活性[11-12]。乳酸菌是公认安全的微生物，通过抑制致病菌QS是发挥它们抗菌性能的主要方式之一[13]，如清酒乳酸菌NR28能在不影响肠出血性大肠杆菌生长前提下，有效降低该菌的AI-2水平及毒力因子表达[14]，海洋源戊糖片球菌zy-B-1的乙酸乙酯提取物对单增李斯特菌AI-2型QS系统也表现良好的淬灭活性[15]，但对来源于水产品中的副溶血弧菌在相关方面的研究相对匮乏。因此，本文以副溶血弧菌为研究对象，探究戊糖乳杆菌DF9的乙酸乙酯提取物对其QS调控系统的抑制效果，为控制与副溶血弧菌相关的污染和感染，以及拓宽乳酸菌的研究和应用领域具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

戊糖乳杆菌DF9 由本实验室从内蒙古牧民自制奶豆腐中分离鉴定得到，保存于本实验的-80 ℃冰箱；副溶血弧菌ATCC17802、哈维氏弧菌BB170均购于广东省微生物菌种保藏中心；胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母粉 广东环凯微生物科技有限公司；酸水解酪蛋白、L-精氨酸 上海源叶科技有限公司；硫酸镁、NaCl、葡萄糖 广州化学试剂厂；蛋白胨、结晶紫 上海麦克林公司；乙酸乙酯 天津富宇化工公司；PI染料、PBS液 上海生工生物工程有限公司；FITC-ConA染料 Sigma公司。

PL602-S天平 Mettler Toledo公司；YXQ-LS-50A灭菌锅 上海博迅公司；150A培养箱 金坛荣华公司；TS-200B摇床 上海天呈科技公司；5417R离心机 Eppendorf公司；Forma ClassⅡA2生物安全柜 Thermo Electron公司；SpectraMax i3x酶标仪 Molecular Devices公司；R1001-VN旋蒸仪、循环水真空泵 郑州长城科工贸公司；BA310-T光学显微镜 Motic公司；EVO MA 15扫描电镜 FEI公司；LSM 7810 DUO激光共聚焦显微镜 Zeiss公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的培养 将戊糖乳杆菌DF9接入MRS培养基中培养12 h（37 ℃）；副溶血弧菌ATCC17802接入 3% NaCl-TSB 培养基中培养 12 h（37 ℃，150 r/min）；哈维氏弧菌BB170接入AB培养基中培养12 h（30 ℃，90 r/min）。上述菌株均活化2代后使用。

1.2.2 戊糖乳杆菌DF9乙酸乙酯提取物的制备 将过夜活化培养的戊糖乳杆菌DF9接入MRS培养基中培养 24 h，离心（4 ℃、8000 r/min、10 min）后以0.45 μm的微孔滤膜进行过滤，得到无细胞发酵液。用等体积乙酸乙酯萃取过夜。取上层乳化层，真空旋转蒸发有机溶剂（37 ℃、120 r/min），将浓缩液进行真空冷冻干燥，得到粉末状提取物，将其溶于TSB或AB培养基中，以0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，配制成浓度为50 mg/mL工作液，将其命名为DF9-QSI，用于后续实验中。

1.2.3 DF9-QSI作用下的副溶血弧菌和哈维氏弧菌BB170的生长 将活化培养的副溶血弧菌或哈维氏弧菌接入孔板内含 DF9-QSI（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL）的 200 μL 的 3%NaCl-TSB培养基或AB培养基中，以未含DF9-QSI组作为阴性对照组。将孔板置于全自动生长曲线仪中恒温（37或30 ℃）培养24 h，定期测定600 nm处OD值。

1.2.4 DF9-QSI对副溶血弧菌AI-2活性的影响 采用哈维氏弧菌BB170生物发光法[16]进行。将副溶血弧菌接种于含 DF9-QSI不同浓度（0、0.2、0.4、0.8 mg/mL）的3% NaCl-TSB培养基中，使菌的终浓度为 107CFU/mL，混匀后培养 12 h，离心、0.22 μm微孔滤膜过滤得无细胞上清液，待用。将过夜活化培养的哈维氏弧菌接种于AB培养基中培养12 h，将细菌重悬至OD595nm为0.8，按1:5000将该菌液与无菌新鲜AB培养基稀释、混匀。再将前述所得的无细胞上清液按1:50与哈维氏弧菌的稀释液进行混合，培养3 h（30 ℃、100 r/min）。避光环境中吸取200 μL菌液于不透明黑色96孔板中，利用酶标仪的化学发光模式对哈维氏弧菌的荧光强度进行定量，以未经DF9-QSI处理的作为对照组。按公式（1）计算DF9-QSI对AI-2的抑制率：

1.2.5 DF9-QSI对副溶血弧菌动力的影响 吸取2 μL 1.2.4中含DF9-QSI的混合菌液分别接于群集、泳动及蹭行三种平板中央，以未含DF9-QSI组作为对照组，平板正置培养24 h（37 ℃）。观察并测量副溶血弧菌的迁移区域大小，并按公式（2）计算抑制率：

式中：dControl表示对照组副溶血弧菌群集/泳动/蹭行的迁移直径（mm）；dDF9-QSI表示 DF9-QSI处理组副溶血弧菌群集/泳动/蹭行的迁移直径（mm）。

1.2.6 DF9-QSI对副溶血弧菌EPS合成量的影响将含 DF9-QSI不同浓度（0、0.2、0.4、0.8 mg/mL）的3% NaCl-TSB培养基1 mL加入48孔板中，孔内接入副溶血弧菌（终浓度为107CFU/mL），并放入无菌玻片，静置培养24 h（37 ℃）。以未含DF9-QSI组作为对照组。孵育后的玻片置于含0.5 mL生理盐水的试管中，振荡30 s，加入等体积的5%苯酚，振荡后加入5倍体积浓H2SO4，振匀，取200 μL测定490 nm处OD值，按公式（3）计算抑制率：

式中：ODControl表示对照组的OD490 nm；ODDF9-QSI表示DF9-QSI处理组的OD490nm。

1.2.7 DF9-QSI对生物被膜生物量的影响 吸取1 mL含 DF9-QSI（0、0.2、0.4、0.8 mg/mL）的 3% NaCl-TSB培养基加入96孔板，每孔内接入副溶血弧菌（终浓度为 107CFU/mL），静置培养 24 h（37 ℃）。弃除孔内上层菌液，孔板经PBS液清洗、恒温固定（60 ℃，30 min）、0.1% 结晶紫室温染色（5 min）、PBS液再清洗、室温干燥及33%冰乙酸脱色（10 min）后，测定595 nm处OD值，计算抑制率。

1.2.8 光学显微镜观察 吸取1.5 mL含DF9-QSI（0.8 mg/mL）的3% NaCl-TSB培养基加入24孔板，每孔内接入副溶血弧菌（终浓度为107CFU/mL），并放入无菌玻片，静置培养24 h（37 ℃）。以未含DF9-QSI组作为对照组。取出的玻片经超纯水润洗3次、0.1%结晶紫染色（5 min）、超纯水再润洗及室温晾干后，置于光学显微镜的油镜下观察。

1.2.9 扫描电镜观察 上述1.2.8中孵育好的样本片经PBS液润洗、2.5%戊二醛液预固定（4 ℃，24 h）、PBS液润洗、1%锇酸后固定（0.5 h）及PBS液再润洗后，依次用系列浓度的乙醇（30%、50%、70%、80%、90%）脱水10 min，再以100%乙醇脱水2次，每次10 min。预处理的玻片再经真空干燥和喷金后，置于场发射扫描电镜（FE-SEM）下观察。

1.2.10 激光共聚焦显微镜（CLSM）观察 上述1.2.8中孵育好的样本片用PBS液润洗后，加入5 μL FITC Con-A 染料染色 30 min（4 ℃），再加入 5 μL PI染料继续染色15 min（4 ℃）。以上操作需在避光下进行。之后将样本片置于激光共聚焦显微镜下观察，激发波长为488 nm，发射波长为510 nm。以ZEN软件对图像进行处理。

1.3 数据处理

以上实验至少进行三次，取其平均值，以SPSS 25.0软件分析均值的显著性差异，P＜0.05则差异具有统计意义。图形采用Graphpad prism 7.0进行绘制。

2 结果与分析

2.1 DF9-QSI作用下副溶血弧菌和哈维氏弧菌BB170的生长

由图1a可知，与对照组相比，当 DF9-QSI浓度≤0.8 mg/mL时，其在一定程度上减缓了副溶血弧菌的生长；当其≥1.0 mg/mL时，DF9-QSI明显延迟副溶血弧菌进入对数生长期的时间，并使到达稳定期的最终菌浓度显著减少（P＜0.05），呈现浓度依赖性的抑制作用。本研究中哈维氏弧菌BB170是作为AI-2信号分子的指示菌，还应排除DF9-QSI对其生长的影响。图1b结果显示，哈维氏弧菌在系列浓度的DF9-QSI处理后，生长趋势与对照组基本保持一致，表明哈维氏弧菌的生长未受到DF9-QSI的影响。为了证明DF9-QSI是通过靶向干扰副溶血弧菌QS调控系统而非抑制菌生长而发挥作用，选用≤0.8 mg/mL的DF9-QSI作进一步的研究。

图1 DF9-QSI处理下副溶血弧菌（a）和哈维氏弧菌BB170（b）的生长变化Fig.1 Growth changes of V.parahaemolyticus (a) and V.harveyi BB170 (b) treated with DF9-QSI

2.2 DF9-QSI对副溶血弧菌AI-2活性的抑制

由图2可知，添加0.2、0.4和0.8 mg/mL的DF9-QSI对副溶血弧菌AI-2活性的抑制率分别为14.45%±8.56%、50.57%±9.15%和66.16%±5.30%，表明DF9-QSI可通过抑制副溶血弧菌的AI-2活性，靶向干扰其QS系统，具有开发新型生物制剂以淬灭副溶血弧菌QS的潜力，但具体哪些物质发挥群体感应淬灭作用还有待后续深入研究。PARK等[14]研究结果证明清酒乳杆菌NR28对野生型大肠杆菌ATCC43894毒力的抑制与降低其AI-2活性相关。PELYUNTHA等[17]发现从发酵葡萄中分离的乳酸菌能有效干扰伤寒沙门菌的AI-2活性和生物被膜形成，从而降低其毒力。

图2 DF9-QSI对副溶血弧菌AI-2活性的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of DF9-QSI on AI-2 activity of V.parahaemolyticus

2.3 DF9-QSI对副溶血弧菌动力的影响

生物被膜的形成是一个逐步的、动态循环的过程，其生命周期大致经历浮游单菌粘附表面、细胞微聚集体形成、三维状生物被膜形成、生物被膜继续发育成熟、菌体脱落变成浮游菌5个过程[2]。鞭毛和菌毛对细菌生物被膜生命周期的早期表面附着及蔓延有利，与细菌QS调控系统密切相关[18]。副溶血弧菌存在鞭毛介导的群集、泳动行为以及菌毛介导的蹭行行为，能增强细菌生物被膜形成能力[19-20]。ENOSBERLAGE等[21]将调控副溶血弧菌鞭毛运动的flgE和flgD基因敲除后，细菌在物体表面的成膜能力明显减弱，且不产生成熟生物被膜。图3显示，DF9-QSI对副溶血弧菌的动力具有抑制作用。在群集培养基上，副溶血弧菌的运动范围达（14.11±1.75）mm，以0.2、0.4和0.8 mg/mL DF9-QSI处理时，对细菌的群集抑制率分别为18.10%±7.63%、33.79%±1.53%和39.06%±0.57%。在泳动培养基上，对照组中的副溶血弧菌泳动性能强，迁移直径为（89.59±0.15）mm，但仅添加0.2 mg/mL DF9-QSI使迁移直径下降至（46.66±0.58）mm，抑制率为 47.91%±0.65%。在蹭行培养基中，0.8 mg/mL 的DF9-QSI几乎抑制了副溶血弧菌的蹭行行为，抑制率高达87.44%±1.06%。上述结果表明，DF9-QSI能明显影响副溶血弧菌鞭毛和菌毛的功能，减弱细菌在早期的转移、黏附和成膜能力。亦有研究发现乳酸菌源QSIs能抑制嗜水气单胞菌[22-23]、单增李斯特菌[15]及哈维氏弧菌[24]的群集和泳动能力，且与致病菌的QS系统相关，这与本文所得结果相类似。

图3 DF9-QSI对副溶血弧菌群集（a）、泳动（b）和蹭行（c）的抑制作用Fig.3 Inhibitory activities of DF9-QSI on swarming (a), swimming (b) and twitching (c) of V.parahaemolyticus

2.4 DF9-QSI对副溶血弧菌生物被膜形成及其EPS合成的抑制

群体感应影响细菌的生物被膜的形成。由图4可知，DF9-QSI抑制副溶血弧菌生物被膜的形成，三种浓度下的抑制率分别为5.06%±7.75%、44.46%±6.91%和60.97%±8.31%。结合上述实验结果，表明DF9-QSI能显著抑制副溶血弧菌的QS系统，进而破坏细菌生物被膜的形成。

EPS具有粘性，能使细胞聚集并相互连接形成微菌落，推动生物被膜向成熟阶段发展。因此，EPS在加强细菌与底物之间结合，维持生物被膜三维结构完整性以及对抗外界环境压力方面具有重要意义[25-26]。图4显示，随着DF9-QSI浓度的增大，对副溶血弧菌EPS合成的抑制率也逐渐增大；以0.2、0.4和0.8 mg/mL的DF9-QSI处理时，对副溶血弧菌EPS合成的抑制率分别为20.25%±9.20%、41.65%±7.35%和60.39%±1.81%，表明DF9-QSI可有效阻止副溶血弧菌产生EPS。NITHYA等[27]报道了奇异变形杆菌和短小芽孢杆菌S6-15的培养提取物能降低副溶血弧菌、铜绿假单胞菌等10种病原菌的疏水性指数和EPS产量，此外这些提取物对致病菌成膜能力的抑制率达80%～95%。聚球藻细胞提取物对哈维氏弧菌和创伤弧菌的成膜能力及EPS产量的抑制率均在65%以上，且无抗菌活性，也能有效防止致病菌成熟生物被膜的初始附着，并破坏其结构[28]。

图4 DF9-QSI处理下副溶血弧菌成膜量及EPS合成量的变化Fig.4 Changes of biofilm formation and EPS synthesis of V.parahaemolyticus treated with DF9-QSI

2.5 光学显微镜和场发射扫描电镜下观察的生物被膜形貌变化

光学显微镜和场发射扫描电镜可直观观察DF9-QSI作用下的副溶血弧菌生物被膜形貌变化，结果如图5所示。在光学显微镜下，对照组中的副溶血弧菌在盖玻片上形成片状、厚且紧密的生物被膜，在处理组中仅能见到零碎的微菌体或单菌落，无片状生物被膜存在。经过相同系列的固定、洗涤等预处理后，在场发射扫描电镜视野下仍能观察到对照组中的副溶血弧菌菌体聚集形成三维结构的生物被膜，处理组中仅能见到散落分布的菌体。以上显微观察结果表明DF9-QSI明显降低了副溶血弧菌的成膜能力。类似地，孙梦桐等[24]利用光学显微镜和扫描电镜观察发现8.0 mg/mL的乳酸乳球菌LY3-1粗提物处理后的哈维氏弧菌菌体分散分布，生物被膜结构丧失。

图5 光学显微镜（a，1000×）和 FE-SEM（b，3500×）观察DF9-QSI处理下副溶血弧菌生物被膜结构的变化Fig.5 Changes of biofilm structure of V.parahaemolyticus treated by DF9-QSI observed under light microscope(a, 1000×) and FE-SEM (b, 3500×)

2.6 激光共聚焦显微镜下观察的生物被膜形貌变化

细菌生物被膜中EPS的分布及其空间结构的变化可利用荧光染料结合激光共聚焦显微镜技术进行观察[29]。图6结果表明未处理的副溶血弧菌分布密集，菌体被大量EPS（绿色荧光）包裹和覆盖，形成的生物被膜结构有厚度、完整；而DF9-QSI处理后，膜中的EPS覆盖面积显著减少，厚度明显降低，表明细菌形成的生物被膜完整结构被破坏。该结果进一步说明DF9-QSI有效抑制了副溶血弧菌生物被膜的形成量及其EPS的合成。

图6 激光共聚焦显微镜观察DF9-QSI对副溶血弧菌生物被膜的影响Fig.6 Effect of DF9-QSI on the biofilm of V.parahaemolyticus observed by CLSM

3 结论

QS介导细菌的信号交流系统是微生物世界中常见的现象，然而有害菌依赖QS信号分子调控形成的生物被膜给抗菌剂（防腐剂、消毒剂、抗生素等）的有效性带来巨大挑战，是造成细菌感染、持续性污染和多重耐药的主要原因。因此，细菌的QS和生物被膜形成是食品安全和医疗卫生等领域面临的难题。与常规使用的抗菌剂相比，QSIs的优势是能以QS为靶标，在不杀死细菌的前提下，有效降低病原菌的致病性和抗性[30]。本文探究了亚抑菌浓度的DF9-QSI对副溶血弧菌QS系统相关生物表型的影响。结果发现，≤0.8 mg/mL的DF9-QSI基本不影响副溶血弧菌的正常生长，但能有效抑制其AI-2活性、运动（群集、泳动和蹭行）、生物被膜形成及EPS合成，且随浓度增大，抑制作用明显增强。光学显微镜、场发射扫描电镜和激光共聚焦显微镜结果表明DF9-QSI有效抑制了副溶血弧菌生物被膜的形成。因此推测DF9-QSI可能通过降低副溶血弧菌的AI-2活性，进而减弱其生物被膜形成早期阶段中浮游菌借助鞭毛、菌毛进行的表面起始粘附的能力，并抑制细菌分泌具有粘连菌体且推动生物被膜发育成熟的EPS的合成能力，最终抑制副溶血弧菌生物被膜的形成。本研究结果证实DF9-QSI具有淬灭副溶血弧菌AI-2类QS系统的作用，可为有效解决该菌在食品、医疗卫生上的污染和感染等问题提供一种可行的方法，并进一步提高乳酸菌作为生物源性QSIs的应用价值。然而DF9-QSI影响细菌QS以及调控生物被膜的相关分子机理还有待深入研究。