GC-MS法测定橡胶材料中N-亚硝基胺的不确定度评定

刘志荣

（中轻检验认证（晋江）有限公司，福建 晋江 362200）

前言

N-亚硝基胺，化学通式为R2N-NO,其可以通过消化道和呼吸道进入人体，同时可以通过人体皮肤接触进入人体，诱发癌症，同时能够引起肝坏死等危害，而被人们所广泛关注[1]。橡胶材料在生产过程中需要添加一些促进剂，在其硫化过程中会形成亚硝酸类物质而残留其中。在特定环境下橡胶材料中残留的亚硝基胺容易被释放出来，对人体造成伤害。科研工作者进行了大量的试验，已证明N-亚硝基胺在人类体内可能会将DNA 烷基化，最终诱发癌症[1-2]。

随着居民家庭收入的提高，童鞋市场规模的不断扩大，我国童鞋产业迅速扩张，橡胶制品是童鞋的主要材料之一，童鞋甚至是婴幼儿鞋类质量安全对于儿童健康成长发育有一定的影响[2]。国际上多个国家或地区专门制定针对鞋类橡胶材料中N-亚硝基胺含量的检测方法，例如ISO 19577-2019[3]Footwear-Critical substances potentially present in footwear and footwear components Determination of Nitrosamines。对于鞋类产品橡胶部件中N-亚硝基胺含量的要求，国内相继出台了多个标准对其进行限定，最为常见的为GB 30585-2014[4]中要求婴幼儿鞋的橡胶部件中不应检出N-亚硝基胺。欧盟在2009/563/EC 的鞋类生态标签指令中[2]，对9 种N-亚硝基胺进行限定，要求不得检出。

通过不确定度各分量来源的分析和计算，可以评估检测结果的准确性，从而提高检测质量。本文根据GB/T 27418-2017[5]《测量不确定度评定与表示》及JJF 1135-2005[6]《化学分析测量不确定度评定》中的相关规定，依据GB/T 24153-2009[7]对鞋类材料中N-亚硝基胺的测定方法，考虑标准品、工作曲线的拟合、样品测定重复性、称量及标准溶液配置等方面进行不确定度的评定，为气质联用法准确测定橡胶材料中N-亚硝基胺的含量提供参考[8-9]。

1 材料与试验方法

1.1 实验原理

橡胶试样采用甲醇作为提取溶剂，在超声波下提取，提取液使用旋转蒸发仪浓缩，再使用C18 固相萃取小柱净化，样液进GC-MSD 进行测定，全扫描定性，选择离子定量[7]。

1.2 仪器及试剂

5977B-7890B 气质联用仪(安捷伦科技公司)；电子分析天平（精度0.001 g，梅特勒-托利多集团）；高功率超声清洗器（KQ-400KDE，昆山市超声仪器公司）[10]；甲醇（色谱纯，Tedia 公司）[10]；旋转蒸发仪（可控温35 ℃，广州仪科实验室技术公司）；C18 固相萃取小柱；12 种N-亚硝基胺混合标液(曼哈格生物科技)其中12 种混合标准溶液中分别为：N-亚硝基二甲基胺CAS:62-75-9 N-亚硝基甲基乙基胺CAS:10595-95-6 N-亚硝基二乙基胺CAS:55-18-5 N-亚硝基吡咯烷CAS:930-55-2 N-亚硝基-N-甲基苯胺CAS:614-00-6 N-亚硝基吗啉CAS:59-89-2 N-亚硝基二丙基胺CAS:621-64-7 N-亚硝基哌啶CAS:100-75-4 N-亚硝基-N-乙基苯胺CAS:612-64-6 N-亚硝基二丁基胺CAS:924-16-32 N-亚硝基二苯基胺CAS:86-30-6 N-亚硝基二苄胺CAS:5336-53-8 以下内容用CAS 号表示该物质。

1.3 标准溶液配制

1.3.1 N-亚硝基胺12 种混标中间液的配制

取0.5 mL N-亚硝基胺混标（12 种）母液（200 mg/L）至10 mL容量瓶，定容至刻度线，得到浓度为10 mg/L 的储备液。

1.3.2 N-亚硝基胺12 种混标工作液的配制

根据表1 所示移取1.3.1 中储备液配置成标准工作液。

表1 N-亚硝基胺标准工作液配置表

1.4 样品处理

1.4.1 试样制备及提取

称取5.0 g（准确至0.01 g）边长为3 mm 以下的试料，于加入30 mL 甲醇的反应器里，使用高功率超声清洗器进行超声30 min，然后把溶液移入浓缩瓶中。再次加入20 mL 甲醇于反应器中，提取第2 次，然后合并溶液[7]。

1.4.2 蒸发浓缩

将浓缩瓶置于35 ℃水浴，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩至4.5mL 左右，将样液移入5mL 容量瓶，另取0.5mL 提取溶剂淋洗瓶壁内部，再次振荡1min，移入上述容量瓶，用提取液定容至5mL[7]。

1.4.3 净化

用5 ml 甲醇活化C18 小柱，用移液器量取2.0 ml 样液于C18 小柱里，收集流出液于离心管，再加2 mL 甲醇淋洗，收集洗液于离心管。最后氮吹至2 mL,供气质联用测试[7]。

1.5 仪器参数

a）色谱柱：DB-35MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm 或相当者；

b)色谱柱温度：起始温度40℃（保持4 min）以8 ℃/min 速率加热到83 ℃(保持4 min）以15 ℃/min 速率加热到280 ℃(保持6 min)；

c)进样口温度：260 ℃；传输线温度：280 ℃[11]；

d)质量扫描范围：(15-280)amu；测定方式：SIM；电离方式：EI，能量70 eV[11]；

e)进样：不分流；进样量：1 微升。

2.1 不确定度分析

2.1.1 数学模型

X-橡胶材料中N-亚硝基胺的含量，单位mg/Kg；C-从工作曲线中N-亚硝基胺的浓度，单位；V-提取液的体积，单位mL；m-样品的质量，单位g。

2.1.2 称样引入的相对标准不确定度urel(1)

采用0.001 g 电子分析天平，根据校准证书上示值误差为0.002 g，因此天平引入的相对标准不确定度：

2.1.3 标准品引入的相对标准不确定度urel(2)

根据标准品厂商提供的证书，在置信水平95%，k=2，各个N-亚硝基胺类的相对标准不确定度均为0.03000。

2.1.4 标准工作溶液浓度引入的不确定度urel(3)

以N-亚硝基二甲基胺（CAS：62-75-9）为例，那么不确定度的来源主要为：10 mL 容量瓶、1000 μL 移液器和环境温度对体积产生的影响[10]。

根据10 mL 容量瓶校准证书可知，体积误差为0.007 mL，那么相对标准不确定度。

根据1000 μL 移液器校准证书给出的误差为0.004 mL，那么相对标准不确定度为。

甲醇在20 ℃下的膨胀系数为0.0011/℃，温度引入的相对标准不确定度按矩形分布计算，试验环境温度允差为5 ℃，因此温度引起的相对标准不确定度

因此，由62-75-9 标准工作溶液浓度引起的不确定度u(62-75-9)rel(3)为：

2.1.5 重复性引入的相对不确定度urel(4)

测试加入标准溶液为1.5 mg/kg 的空白样品进行六次重复性测试结果见表2，重复性引入的相对标准不确定度为以u(62-75-9)rel

表2 样品测量重复性引入的相对不确定度

(4)为62-75-9 例计算为：

2.1.6 工作曲线的拟合引入的不确定度urel(5)

本文采用外标法定量，以62-75-9 为例工作溶液5 个浓度点分别为250、500、750、1000、1500 μg/L 的12 种N 亚硝基胺类工作溶液分别测定1 次，得到的响应值为纵坐标，浓度值为横坐标，拟合工作曲线得 到 y=bCi+a=102.6Ci-1307，截 距a=-1307，斜率b=102.6，n=5，样品重复测量两次，那么标准偏差S 为[10]：

根据u(5)公式计算工作曲线拟合引入的标准不确定度为[10]：

式中：n——测试标准溶液的次数，n=5；P——测试样品的次数，P=2；C——测定样品中62-75-9 浓度平均值，C=1463.28；——N 亚硝基胺标准溶液浓度平均值，=800；Ci——标准系列溶液的浓度值；b——标准曲线的斜率。S——标准偏差[10]。

表3 工作曲线的拟合引入的相对标准不确定度

2.1.7 合成及扩展不确定度的评定

以62-75-9 为例计算N-亚硝基胺不确定度的结果见表4。62-75-9 合成相对标准不确定度u(62-75-9)crel(c)为：

表4 N-亚硝基胺的不确定度结果

试样中N-亚硝基胺62-75-9 的最终测定结果为1.46mg/Kg，合成标准不确定度为u(62-75-9)(c)=c×u(62-75-9)crel(c)=1.46×0.0316=0.0461 mg/Kg。

在置信概率95%，k=2，那么测量结果的扩展不确定度U(62-75-9)为：U(62-75-9)=k·u(62-75-9)(c)=2×0.0461=0.09 mg/Kg。

62-75-9 结果的表示为：C=(1.46±0.09)mg/Kg，k=2。

3 结论

对于采用气相色谱-质谱联用法测量N-亚硝基胺含量时，由表4 可知，不确定度来源中标准品和工作曲线对测定过程不确定度最大。

根据评定不确定度的结果，日常检测中需采取措施减小不确定度的引入。在申购标准品过程中，必须选择不确定度相对较低的标准品，可以有效减小不确定度的引入；建立作业指导书标准化操作步骤和仪器操作规范，提高技术人员能力，减少试验误差；配置标准溶液时减少稀释次数，操作又快又准，也可减小不确定度的引入从而确保检测数据的准确和可靠。