IFN-β促进巨噬细胞细胞分泌IL-6参与干燥综合征相关肺间质病变

姚根宏，李晓静，黄赛赛，潘卿芸，王世颖，赵成

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科，南京210008；2.南京大学金陵学院化学与生命科学学院，南京 210089)

原发性干燥综合征(primary Sjögren′s syndrome, pSS)是一种慢性系统性自身免疫病，主要侵犯泪腺、唾液腺等外分泌腺，典型症状表现为口、眼干燥[1]。pSS腺体外并发症可累及肺脏、甲状腺、肾脏等多器官和系统。pSS相关肺疾病常常表现为间质病变，引发间质性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)[2]。SS相关ILD(SS-ILD)是患者致残和致死的主要原因。因此，深入研究 SS-ILD 发病机制，探索有效治疗方法，具有重要的理论意义和应用前景。

干扰素(interferon，IFN)信号在机体免疫防御和免疫稳态中发挥重要作用，I型干扰素(IFN-I)在免疫失调导致的自身免疫病发生和发展进程中发挥重要作用[3]。IFN-β是IFN-I主要成员之一，近年来的研究表明IFN-β在SS发病中也发挥重要作用[4]。动物实验表明，IFN-β等活化导致SS模型小鼠唾液腺功能受损，而阻断干扰素受体能改善症状[5]。但是，IFN-β参与SS-ILD的具体机制不明。本研究旨在探讨IFN-β在SS-ILD患者中的表达，分析其与临床指标的相关性，并研究IFN-β调控巨噬细胞分泌炎症因子的机制，以期为揭示SS-ILD的发病机制和治疗提供新依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2018年1月至2020年12月于南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科诊治的SS患者。共40例SS患者入组，男性5例，女性35例，年龄22～73岁，其中SS-ILD和不并发ILD的SS患者各20例。所有患者的诊断符合2016年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟(American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism, ACR/EULAR)pSS分类标准[6]。通过胸部高分辨CT证实ILD存在。排除标准：其他结缔组织病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、多发性肌炎/皮肌炎和混合型结缔组织病；其他疾病导致的ILD、慢性阻塞性肺疾病、急性肺部感染、呼吸系统恶性肿瘤、肺栓塞等。采用EULAR干燥综合征疾病活动性指数(EULAR Sjögren′s syndrome disease activity index, ESSDAI)对SS患者活动度进行评分[7]。30名来自南京鼓楼医院体检中心的健康志愿者作为对照组，性别和年龄与SS组匹配。其中,女性26名,男性4名，年龄23～68岁。本研究经南京大学医学院附属鼓楼医院医学伦理委员会批准(20190413)，各研究对象均知情同意。

1.2主要试剂与仪器 人IFN-β和IL-6 ELISA试剂(美国R&D公司)，人THP-1细胞系(中国科学院上海细胞库)，RNA提取试剂、逆转录试剂、SYBR Green PCR Master Mix(诺唯赞公司)，培养基(美国HyClone公司)，胎牛血清(美国Sciencecell公司)，牛血清清蛋白(BSA,美国Sigma-adlrich公司)，佛波酯(南京福麦斯公司)，重组人IFN-β(R&D systems公司)；Onedrop超微量分光光度计(美国Thermo公司)，普通PCR仪(日本TaKaRa公司)，StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，Synergy HT酶联仪(美国BioTek公司)，细胞培养箱(日本SANYO公司)。

1.3血浆中IFN-β和IL-6检测 留取健康人对照者和SS患者2 mL外周抗凝血，400×g离心10 min，分离血浆，并于-80℃冰箱冷冻保存。用ELISA法检测血浆IFN-β和IL-6水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.4人THP-1细胞培养及诱导分化 人THP-1细胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，将传代培养的THP-1细胞接种于6孔培养板中，在含有0.3% BSA的无血清RPMI 1640培养液中加入100 ng/mL佛波酯，培养72 h诱导分化。光学显微镜下观察细胞形态，鉴定细胞分化为巨噬细胞。

1.5重组人IFN-β对巨噬细胞表达IL-6的影响 用40 pg/mL重组人IFN-β处理THP-1细胞分化的巨噬细胞24 h，收集培养上清，-80 ℃冰箱冷冻保存，用于ELISA法检测IL-6水平。按照Trizol试剂说明书提取培养的巨噬细胞总RNA；按照逆转录试剂说明书将RNA逆转录为cDNA；然后取cDNA进行实时定量PCR反应，扩增人IL-6和内参基因GAPDH。引物由金斯瑞生物科技公司设计和合成，引物序列如下。人IL-6上游引物：5′-TGCGCAGCTTTAAGGAGTTC-3′，下游引物：5′-CCCATGCTACATTTGCCGAA-3′；人GAPDH上游引物：5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′，下游引物：5′-CAATGCCAGGGTACATGGTG-3′。PCR反应总体系为20 μL，包含AceQ qPCR SYBR Green Mix (2×) 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，灭菌水8.2 μL。PCR反应参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。在60 ℃时收集每个循环的荧光信号，进行熔解曲线分析。用实时定量PCR仪自带软件分析扩增曲线和熔解曲线中的荧光信号，并计算平均循环阈值(Ct)数，以GAPDH作为内参，通过2-ΔΔCt法计算待测基因的相对表达量。

1.6统计学分析 采用GraphPad 7.0软件进行。正态分布的定量数据以平均值±标准差表示，两组之间比较采用两独立样本t检验；非正态分布定量数据以中位数(四分位数)表示，两组之间比较采用非参数秩和检验；相关性分析采用Pearson方法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1SS患者IFN-β增加且与疾病活动度相关 与健康人对照者血浆IFN-β水平[(4.94±0.73) pg/mL]相比，SS患者血浆中IFN-β[(8.98±0.79)pg/mL]明显增高，差异有统计学意义(t=3.753,P=0.004)。分析SS患者血浆IFN-β与疾病活动度的相关性，发现血浆IFN-β水平与ESSDAI呈显著正相关(r=0.456,P=0.011 3)，见图1。

图1 血浆IFN-β与SS患者疾病活动度评分(ESSDAI)相关性分析

2.2SS-ILD患者IFN-β增高 根据患者是否存在ILD，将SS患者分为SS和SS-ILD患者。结果显示，SS患者血浆IFN-β水平为(6.68±3.64)pg/mL，SS-ILD患者IFN-β水平为(9.71±3.76)pg/mL，两组间差异有统计学意义(t=2.586,P=0.013 7)。

2.3IFN-β促进巨噬细胞分泌IL-6 人THP-1细胞经佛波酯诱导后分化为巨噬细胞，图2A和B可见THP-1细胞从圆形的悬浮细胞分化为贴壁的巨噬细胞。采用40 pg/mL IFN-β处理THP-1细胞分化的巨噬细胞24 h后，定量PCR结果显示细胞中IL-6 mRNA水平明显增加(图2C)，ELISA法检测发现培养上清中IL-6也显著增加(图2D)。

2.4SS-ILD患者IL-6增加 SS-ILD患者血浆IL-6水平显著高于无ILD的SS患者[(5.64±5.03) pg/mL vs(2.13±1.23) pg/mL]，差异有统计学意义(t=2.623，P=0.014)。进一步分析SS-ILD患者血浆IL-6与IFN-β的相关性，结果显示两者呈现显著正相关(r=0.587 7，P=0.006 4)。

注：A，THP-1细胞形态(×100)；B，THP-1诱导巨噬细胞形态(×100)；C，IFN-β处理巨噬细胞后IL-6 mRNA表达，**,P<0.01；D，IFN-β处理巨噬细胞后上清中IL-6水平，*,P<0.05。

3 讨论

SS是一种慢性系统性自身免疫病，肺脏由于具有丰富血管和结缔组织，因而是SS常累及的靶器官，SS-ILD等并发症决定了患者的预后[8]。因此，探索SS-ILD具体发病机制具有为临床提供诊断标志物和治疗新思路的实际意义。

IFN-β一直被认为是机体抵抗外来病毒的固有免疫防御的重要分子[9]。近年研究表明，IFN-β在系统性红斑狼疮和SS等多种自身免疫病中发挥重要作用[10]。本研究结果证实SS患者的IFN-β增多，并且与患者的SS疾病活动度呈正相关。研究表明，SS患者唾液腺局部和外周血单个核细胞、单核细胞和B细胞中IFN-β相关的干扰素刺激基因表达增加，且与疾病活动度和自身抗体相关[11]，与本研究结果一致。另外，临床上应用IFN-β治疗病毒性肝炎时，部分患者出现SS样症状[12]。这些结果提示IFN-β参与SS的发生和进展。但IFN-β在SS-ILD的作用不明。本研究发现SS-ILD患者较未伴有ILD的SS患者血浆IFN-β增高，提示IFN-β参与SS-ILD。临床上，并发ILD的自身免疫病很多，如类风湿关节炎和系统性红斑狼疮患者。本文没有设置类风湿关节炎和系统性红斑狼疮患者对照，因此，IFN-β在其他并发ILD的自身免疫病中的作用和具体机制有待进一步研究。

肺部定居和浸润的巨噬细胞在包括SS-ILD等多种肺部疾病中发挥重要作用[13]。本研究发现，IFN-β作用于巨噬细胞，促进巨噬细胞分泌炎症因子IL-6。促炎因子IL-6不仅可以激活多种免疫细胞，而且与ILD的关系密切，并且ILD患者的体内IL-6水平可以作为预后判断的指标[14]。因此，本研究结果提示IFN-β诱导巨噬细胞生成IL-6，可能是SS-ILD发生发展的机制之一。要明确IFN-β通过IL-6参与SS-ILD的作用，需要特异性敲除SS-ILD小鼠肺部上皮细胞IL-6基因等，这是今后的研究方向之一。本研究为阐明SS-ILD发生新机制和提出SS-ILD患者治疗新思路提供了理论依据。