血红蛋白H包涵体检测对提高α-地中海贫血检出率的意义

马芬，文道林，黄宇飞，张咪咪，刘琛，张润玲，文铖熹

(1.中国科学院大学深圳医院(光明)检验科，广东深圳518107；2.深圳市光明区妇幼保健院检验科，广东深圳518107；3.中山大学公共卫生学院，广东深圳518107)

地中海贫血(以下简称“地贫”)是一组基因突变导致珠蛋白肽链生成障碍的遗传性血液病，主要分布在东南亚、中东、北非和地中海地区[1]。我国长江以南为高发区，广西和广东地区地贫基因携带率分别高达24.51%和11.07%[2]。该病无有效的治疗方法，通过人群筛查对高风险胎儿进行产前诊断以防止重症患儿的出生是当前最有效的措施[3]。地贫主要分为α-地贫及β-地贫两大类，其中α-地贫可引起致死性的 Hb Bart′s胎儿水肿综合征或严重影响生命质量的血红蛋白H病(HbH病)[4]。地贫筛查已成为一项日常工作，为了提高地贫的检出率，血红蛋白电泳作为地贫的重要筛查手段已成为婚检、孕检必不可少的一项检测。但血红蛋白电泳对α-地贫的检测效能不高，容易造成漏诊或误诊。我们在实践工作中发现，如结合血红蛋白H包涵体检测，可提高α-地贫筛查检出率，特别是在防止罕见型α-地贫的漏检中可起到重要作用。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2019年2月至2020年8月婚检、孕检人群平均红细胞体积(MCV)<82 fL和/或平均红细胞血红蛋白含量(MCH)<27 pg，且葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)筛查阴性的标本1 444例，经血红蛋白电泳后，按血红蛋白A2(HbA2)的参考区间分为3组：HbA2升高组280例(HbA2>3.5%)，HbA2正常组490例(HbA2：2.5%～3.5%)，HbA2降低组674例(HbA2<2.5%)；

1.2仪器与试剂 Sysmex XN系列血液细胞分析仪及其配套试剂(日本Sysmex公司)，Helena V8毛细管电泳仪及其配套试剂(美国Helena公司)，ABI2720扩增仪、凯普HB2012A杂交仪及其配套地贫基因检测试剂(潮州凯普公司)，Olympus生物显微镜(奥林巴斯公司)，新亚甲蓝染液(珠海贝索公司)。

1.3方法 采集研究对象静脉血，EDTA-K2抗凝，采用Sysmex XN系列血液细胞分析仪检测血常规，选取MCV和/或MCH低于参考区间的标本，用比值法筛查G6PD，并进行血红蛋白电泳，分析血红蛋白A(HbA)、HbA2、血红蛋白F(HbF)。EDTA-K2抗凝血与新亚甲蓝染液按1∶2混合后37 ℃温育1 h，推片镜检，油镜下查找血红蛋白H包涵体。采用PCR-导流杂交法检测3种缺失型α-地贫(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3种非缺失型α-地贫(CS、QS、WS)及17种常见β-地贫突变。

1.4统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血红蛋白H包涵体形态 标本染色后在显微镜下查找血红蛋白H包涵体，镜下可见血红蛋白H包涵体呈颗粒状，弥漫而均匀地分散在红细胞内。见图1。

图1 油镜下的血红蛋白H包涵体与网织红细胞形态

2.2地贫基因及血红蛋白H包涵体检测结果 见表1。1 444例MCV和/或MCH降低且G6PD筛查阴性的标本中，血红蛋白H包涵体检测阳性342例，其中确认为α-地贫基因携带336例，约占98.2%(336/342)。

2.3α-地贫临床类型与血红蛋白H包涵体检测结果 共检出α-地贫基因携带481例(其中4例为HbA2升高的复合β-地贫)。336例血红蛋白H包涵体阳性标本中，标准型α-地贫300例，约占89.3%(300/336)。145例未检出血红蛋白H包涵体标本中，静止型α-地贫112例，约占77.2%(112/145)。HbA2正常且未检出血红蛋白H包涵体的样本，5例均为静止型，占该组100%(5/5)，HbA2降低且未检出血红蛋白H包涵体的样本中，107例为静止型，约占该组77%(107/140)。各组检出α-地贫基因型别见表1。

表1 各组血红蛋白H包涵体及α-地贫基因检测结果

2.4罕见型α-地贫基因 本研究中有2例标本，1例HbA2正常，另1例HbA2降低，常规地贫基因检测结果未检出突变，表型筛查阳性且血红蛋白H包涵体检测阳性，经进一步检测分析均确诊为泰国型(--THAI)缺失α-地贫。

2.5血红蛋白H包涵体筛查效能 以基因检测结果为参考标准，分析血红蛋白H包涵体对α-地贫筛查的效能，见表2。

表2 血红蛋白H包涵体检测对不同类型α-地贫筛查的效能(%)

3 讨论

中国南方为地贫高发地区，目前广泛实施的大规模人群防控已取得了实质性效果,但如果没有成熟的预防机制，仍然存在着地贫患儿增加的风险。在临床实践中，其表型筛查包含血细胞参数和血红蛋白分析，以HbA2≥3.5%，对β-地贫筛查的敏感性和特异性可达到100.00%、99.33%[5]；但以HbA2≤2.5%,对α-地贫筛查的敏感性、特异性分别为：深圳地区89.5%、54.8%[6]，佛山顺德地区60.5%、89.4%[7]，中山市育龄夫妇75.4%、72.0%[8]。部分α-地贫个体表现为HbA2水平正常，借助毛细管电泳法筛查α-地贫，敏感性和特异性均不佳。如果仅凭借血细胞分析和血红蛋白电泳作为地贫初筛方法，α-地贫漏检高于β-地贫。据此，如何将红细胞参数结合其他血液学指标，提高筛查的敏感性与准确性，是地贫筛查临床实践中所面临的具体问题。

红细胞H包涵体为不稳定血红蛋白、血红蛋白H等异常血红蛋白在红细胞内发生沉淀形成的变性珠蛋白小体。在α-地贫中,由于α链减少，冗余的β链聚合、沉淀而形成血红蛋白H包涵体，即β四聚体，可通过特殊染色后在显微镜下观察到。血红蛋白H包涵体一般温育1 h就可出现，而其他不稳定血红蛋白形成包涵体需温育更长时间(3 h或更长)，HbH病(中间型α-地贫)血红蛋白H包涵体可为1～3+，标准型(轻型α-地贫)血红蛋白H包涵体多为偶见。在临床工作中，多数患者的血红蛋白H包涵体含量很低，约占红细胞总数的1/100 000，易造成假阴性结果[9]，鉴于此，很多医院已不再进行血红蛋白H包涵体的检测。但本研究结果表明，经典的血红蛋白H包涵体检测对α-地贫筛查的意义明显，结合血红蛋白H包涵体检测，标准型α-地贫筛查的敏感性达90.1%，特异性可达99.8%。

HbA2>3.5%通常提示为β-地贫，如有血红蛋白H包涵体的检出可提示复合α-地贫。本研究中，4例HbA2升高的α-/β-复合地贫中，即有3例检出H包涵体，充分说明了包涵体检测对α-地贫筛查的重要意义。静止型和标准型α-地贫携带者的HbA2正常或降低不明显，通常不能作为筛查的特异性参数[10]。文献报道，HbA2对静止型和标准型α-地贫的筛查存在较多漏检，不宜单纯依靠HbA2结果进行α-地贫筛查[11]。本研究结果表明，HbA2正常组，结合血红蛋白H包涵体检测对α-地贫诊断的敏感性可达90.6%，大大提高α-地贫特别是标准型α-地贫的筛查阳性率。

目前，基因检测是诊断地贫的金标准[12-13]，但常规商业化试剂盒只包含了常见的突变类型，罕见变异或未知突变的漏检率约为2%[14]。对有地贫表型却未检出地贫基因突变的标本，则需根据标本的表型参数特征而进一步的检测分析。由此可见，根据表型与基因型一致的地贫诊断原则，有助于判定基因诊断的准确性，也有助于指导罕见或少见地贫基因的进一步检测分析。本研究中，有2例标本为地贫表型而未检出试剂盒所包含范围的地贫基因，血红蛋白H包涵体阳性，经进一步检测确诊为α-地贫泰国型缺失携带者。据此，如检出血红蛋白H包涵体的未知标本，基因检测即可重点聚焦α-地贫基因，为基因检测提供方向。

综上，在当前血常规红细胞参数检测、血红蛋白组分电泳分析的表型筛查常规应用情况下，结合血红蛋白H包涵体的检测，可明显提高表型筛查的敏感性与特异性，为后续的基因检测提供更全面、更有价值的参考信息。但血红蛋白H包涵体在大多数的α-地贫患者外周血中含量非常低，查找血红蛋白H包涵体需要检验人员具备耐心和责任心。