凝固曲线波形分析的临床应用

孙胜利，吴卫

(中国医学科学院北京协和医院检验科，北京100730)

凝固曲线波形分析(clot waveform analysis，CWA)是由用光学法原理检测凝血酶原时间(prothrombin time，PT)和活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)等凝血指标的凝血分析仪在凝固反应过程中依据透射光/散射光变化所绘制的凝固曲线波形图，进行求阶导数得出凝血反应过程中最大反应速度、最大凝血加速度、最大凝血减速度，为凝血反应过程提供了更多信息。典型的APTT凝固曲线及求阶导数为例，如图1，APTT凝固曲线为图形A，x轴表示时间(s)，y轴表示透射光强度(%),最大透射光强度为100%，最小透射光强度为0%。在0～100%之间，选择预先设定的终点(一般设定50%)，并确定此终点下的凝血时间(CT，s)；图B为透射光强度的一阶导数，反映了每个时间点的凝血速度，|Min1|(dT/dt)为最大反应速度；图C为透射光强度的二阶导数，反映了每个指定时间点的反应加速度，|Min2|(d2T/dt2)为最大凝血加速度，|Max2|(d2T/dt2)为最大凝血减速度；CWA参数可以获得整个凝血过程的更多信息[1-2]。1997年，Braun等[3]分析了血友病患者CWA参数的变化，首次提出利用光学透射率数据可以对APTT和PT检测结果进行扩展性解释。2013年国际血栓与止血协会(International Society of Thrombosis and Haemostasis,ISTH)推荐CWA应用于临床[4]，越来越多的研究者开始关注CWA的临床应用。本文就CWA在血栓、血友病、纤维蛋白原缺乏等疾病中的应用进行综述。

注：A，APTT凝固曲线；B，透射光强度一阶求导；C，透射光强度二阶求导。

1 血栓

静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)包括深静脉血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)与肺栓塞(pulmonaryembolism，PE)，是住院患者潜在的一种并发症，是导致住院患者死亡的重要原因之一[5]。VTE发病率和死亡率高，但又有可预防，因此早期评估和诊疗显得至关重要[6]。

Padua评分是一种个人风险评估模型，按总得分情况分为低危(<4分)、高危(≥4分)[7]。《美国胸科医师学院内科患者VTE预防指南》(第9版)建议：Padua评分≥4分患者，VTE患病风险高，应采取VTE预防措施[8]。Ruberto等[9]将801名治疗患者分为3组，得出高PPS(Padua评分)患者APTT|Min1|、|Min2|、|Max2|值以及纤维蛋白原、D-二聚体高于低PPS患者和健康者。高PPS、低PPS患者和健康者的APTT的|Min2|、|Max2|值和纤维蛋白原、D-二聚体与高PPS评分≥4分显著相关。研究表明，无论是否有抗血栓预防措施，可通过APTT检测的一阶导数、二阶导数和D-二聚体而预测高凝状态，APTT的CWA参数、纤维蛋白原和D-二聚体可用于区分高风险PPS和低风险PPS患者，达到VTE的早期预防和治疗。

新型直接口服抗凝药物(direct oral anticoagulant agents，DOACS)因其不需要进行常规抗凝监测、服用剂量相对固定、剂量反应可预测、不受饮食影响，以及药物相互作用较少[10]，被用于房颤的血栓预防[11]。2016年美国胸科协会建议使用直接口服抗凝药治疗因非癌症引起的深静脉血栓[12]。Wakui等[13-14]研究表明直接凝血酶抑制剂和活化因子Ⅹ抑制剂的剂量与APTT检测时间呈剂量依赖性延长，APTT的CWA参数Min1(|Min1|)、Maxp2(|Min2|)、Maxn2(|Max2|)呈剂量依赖性下降。

2 血友病

血友病是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，可分为血友病A和血友病B。前者表现为凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺乏，后者表现为凝血因子Ⅸ(FⅨ)缺乏，均由相应的凝血因子基因突变引起。根据FⅧ或FⅨ的活性水平将血友病分为重型(因子活性<1 %)、中间型(因子活性为1%～5%)、轻型(因子活性为>5 %,≤40 %)[15]。

1997年，Braun等[3]分析了血友病中CWA参数的变化，首次提出利用光学透射率数据可以对APTT和PT检测结果进行扩展性解释。Shima等[16]研究表明，APTT的完整CWA参数比凝血时间和/或单阶段因子分析在确定血友病的临床严重程度方面提供了更有效的鉴别力，与Matsumoto等[17]研究一致。且Matsumoto等[17]研究还表明APTT |Min2|在检测FⅧ低值(<1.0 IU/dL)方面比FⅧ:C凝血试验更准确。同时Matsumoto等[18]研究表明FⅧ浓度在0～100 IU/dL之间APTT检测的CWA参数CT、|Min1|和|Min2|与FⅧ浓度呈良好的剂量关系，FⅧ:C最低水平为0.25 IU/dL。56例严重血友病A患者研究发现所有患者的CT检测值均延长，但是组间差异不明显。血友病A伴抑制物阳性组APTT的 CWA参数|Min1|和|Min2|明显低于正常对照组和其他血友病实验组(P<0.05)，新的研究参数Slope[min1]为凝血前期纤维蛋白原形成过程中最大反应速度，在鉴别血友病A伴抑制物阳性、极严重Ⅷ缺乏(<0.25 IU/dL)及严重Ⅷ缺乏(0.25～0.50 IU/dL)均有鉴别意义。

血友病领域首个双特异性抗体Emicizumab，是一种模拟激活FⅧ辅因子功能的抗Ⅸ/FⅩ双特异性抗体。2017年11月，FDA批准emicizumab (商品名：Hemlibra®)用于血友病A FⅧ抑制物阳性的成人和儿童患者常规预防，以预防或减少出血的频率。2018年10月，FDA又批准emicizumab用于不具有抑制物的血友病A患者常规预防，通过每周 (或更低频率)皮下注射给药，emicizumab预防血友病A患者的出血率显著降低[19-21]。Emicizumab治疗血友病A时不需要凝血酶激活，因此治疗过程中APTT监测作用微乎其微。

血友病A、B患者在输入凝血因子进行治疗过程中，有研究推荐治疗的凝血因子Ⅷ与Ⅸ活性水平相等[22-23]，也有研究表明Ⅸ因子水平应低于Ⅷ因子[24-25]。Yoo等[26]研究表明在注射CFCs后检测发现|Min2|在血友病A患者、血友病B患者明显低于正常人，但是血友病A患者与血友病B患者差异无统计学意义(P=1.0)。

3 纤维蛋白原缺乏

纤维蛋白原缺乏是一种罕见的孤立的遗传性缺乏或一种获得性弥漫性血管综合征的一部分，是血浆中缺乏纤维蛋白原引起出血表现的一种疾病[27]。纤维蛋白原缺乏主要分为遗传性纤维蛋白原缺陷和继发性纤维蛋白原减低。遗传性纤维蛋白原缺陷症的分类依据如下：(1)遗传性纤维蛋白原缺乏症(Ⅰ型):按照血浆纤维蛋白原减少的程度不同，可分为无纤维蛋白原血症和低纤蛋白原血症(纤维蛋白原减少症)，纤维蛋白原≤0.9 g/L可诊断为低纤维蛋白原血症；≤0.5 g/L可诊断为无纤维蛋白原血症[28]。(2)异常纤维蛋白原血症(Ⅱ型):它是由于纤维蛋白原分子结构发生基因缺陷所致的一组高度异质性的遗传性疾病, 主要是纤维蛋白原结构基因的突变导致纤维蛋白原分子结构及功能缺陷所致，大多为常染色体显性或共显性遗传。约55%的患者无临床症状，25%的患者仅有出血倾向，20%的患者有血栓表现伴出血倾向，可有伤口愈合不良和流产等表现[29]。

实验室常规光学法全自动血凝分析仪检测纤维蛋白原的原理为Clauss活性法，报告为纤维蛋白原的活性(Clauss法)结果，无法提供纤维蛋白原抗原含量的测定结果，而鉴别纤维蛋白原异常为质的异常还是量的异常，对临床诊断及治疗监测更具指导意义。Suzuki等[30]的研究表明，使用Clauss法检测纤维蛋白原值与纤维蛋白原|Min1|的比值Ac/|Min1|可以较好判断是单纯异常纤维蛋白原血症或低纤维蛋白原血症，还是二者合并的低异纤维蛋白原血症。单纯的异常纤维蛋白原血症Ac/|Min1|明显低下，而低纤维蛋白原血症和低异纤维蛋白原血症显著升高，单纯低纤维蛋白原血症升高更明显。Suzuki[30]建立了血浆纤维蛋白原抗原含量和|Min1|值的标准曲线，从每个纤维蛋白原|Min1|值计算估计的纤维蛋白原Ag(eAg)，作为测定纤维蛋白原抗原含量的合适替代物，可以区分异常纤维蛋白原的Ⅰ型(定量缺陷)和Ⅱ型(定性缺陷)，Ac/eAg在异常纤维蛋白原血症和低异纤维蛋白原血症中明显低于正常人。

4 其他

抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome,APS)是一种非炎症性自身免疫病，血清中存在抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody，APL)[31]。APL包括狼疮抗凝物(lupus anticoagulant， LA)、抗心磷脂抗体(anticardiolipid antibody，aCL)、抗β2糖蛋白Ⅰ抗体(抗β2-GPⅠ抗体)及抗凝血酶原抗体等。Matsumoto[32]研究表明在LA-APS(+)、LA-APS(-)、获得性血友病A患者中APTT检测时间显著延长，但是组间差异没有统计学意义(P>0.05)，|Min1|在所有组均减低，LA组略高于轻型/中间型血友病A(FⅧ活性>1 IU/dL)患者和获得性血友病A患者，在获得性血友病A、轻型/中间型血友病A、LA-APS(-)和LA-APS(+)患者中|Min1|均减低，轻型/中间型血友病A与获得性血友病A患者中|Min1|明显减低，各组间|Min1|值差异有统计学意义(P<0.05)。

弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)不是一种独立的疾病，而是许多疾病在进展过程中产生凝血功能障碍的最终共同途径，是一种临床病理综合征。1997年Downey等[33]观察到与APTT正常凝固反应S曲线相比，诊断为DIC的患者在APTT检测时可出现异常且特征鲜明的透射率波形外观，凝血反应开始前的初始平台被一个斜坡所取代，形成非典型的双相。1998年Downey等[34]通过1 470个标本连续两周的检测APTT，观察APTT凝固反应曲线，得出非典型双相对DIC的阳性预测值为74%。Toh等[35]证明了双相波形背后的机制是体内C反应蛋白与极低密度脂蛋白之间的复合物，先天因子缺陷、获得性凝血抗体和抗凝治疗的患者不表现出非典型双相(BPW)，这为DIC的分子发病机制提供了潜在的重要见解。

5 小结与展望

PT、APTT、Fbg、TT是出血性及血栓性疾病筛查的常规检验项目。目前采用全自动血凝分析仪以光学法检测PT、APTT、Fbg、TT，仅表示固定某一点的结果，而不能反映凝血过程更多的信息。CWA可提供光学检测系统识别血栓形成过程的分析曲线，通过透光率或吸光率变化，提供凝固过程的信息。PT、APTT、Fbg、TT结果结合自身相应CWA参数数据，可提供多个定量参数，从而提升了PT、APTT、Fbg、TT的临床报告的指标价值。