circ_0092306靶向miR-411调控胃癌细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的机制研究

赵德贞 孔超 李印虎

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，具有较高的发病率和致死率[1]，严重威胁人类的生命健康。胃癌发病隐匿，多数患者确诊时已处于中晚期，错过最佳手术治疗时间[2]。探究胃癌发生发展的分子机制并寻找治疗靶点尤为重要。环状RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)是两类小分子非编码RNA，且二者可靶向结合，参与胃癌在内多种肿瘤的发展进程[3,4]。有报道称，circ_0092306在胃癌组织和细胞中表达上调，其促进胃癌的发展进程[5]。研究显示，miR-411在宫颈癌[6]、结肠癌[7]、肾细胞癌[8]等肿瘤中呈低表达，其作为抑癌基因参与这些肿瘤的发生发展。但目前，circ_0092306能否靶向调控miR-411影响胃癌的发生发展还未知。因此，本研究首先检测了胃癌组织和细胞系中circ_0092306和miR-411的表达，并以胃癌细胞为研究对象，观察了circ_0092306能否靶向调控miR-411影响胃癌细胞的增殖、凋亡和上皮间质转化，以期了解胃癌发生发展的机制并为其靶向治疗提供新靶点。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集30例2016年5月至2018年12月于本院行手术治疗的胃癌患者的癌组织和癌旁组织，液氮保存。其中男21例，女9例；平均年龄(60.53±7.21)岁。依据TNM分期不同，Ⅰ期4例，Ⅱ期9例，Ⅲ期17例。纳入标准：均为首发病例；术前未进行放疗和化疗等治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者；合并肝、肾等脏器功能障碍者；合并自身免疫系统疾病患者。本研究经本院伦理委员会批准同意，患者或家属知情同意。

1.2 细胞与试剂 正常胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞系(N87、HGC-27、AGS)，中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)，美国Hycolne公司；RPMI 1640培养基和细胞计数试剂盒-8(CCK-8)，北京索莱宝科技有限公司；Trizol试剂和LipofectamineTM 2000试剂盒，美国Invitrogen公司；PCR引物、circ_0092306小干扰RNA(si-circ_0092306)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-411 模拟物(mimcs)、模拟对照序列(miR-NC)、miR-411抑制剂(anti-miR-411)、抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)、 circ_0092306野生型质粒(WT-circ_0092306)和突变型质粒(MUT-circ_0092306)，上海生工生物工程有限公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(Vimentin)多克隆抗体，美国Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养:复苏正常胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞系(N87、HGC-27、AGS)，均加含10%FBS的RPMI 1640培养基置于37℃、CO2体积分数5%、湿度97%的培养箱中培养。将对数生长期的GES-1、N87、HGC-27、AGS细胞均以2.5×104个/孔接种于24孔板中，培养24 h后，收集细胞，检测细胞中circ_0092306和miR-411水平。

1.3.2 RT-qPCR检测circ_0092306和miR-411表达水平:Trizol试剂提取组织或细胞中总RNA，逆转录为cDNA后行PCR扩增。扩增程序：95℃3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环。引物序列：circ_0092306上游5’-GTACGCTCTCGAGGAGCTCCTC-3’，下游5’-CGAATAGCGTAGAGAGTCC-3’；GAPDH上游5’-CGTTAACTATATTCTCGGGCCG-3’，下游5’-GCGCGATATCTCCTGCCGAGCTC-3’；miR-411上游5’-CTCTACAGCGATAACAGAAAC-3’，下游5’-CCCGATAAGTCCGTACTA-3’；U6上游5’-CGATAGCTAGCCTATCTCGAA-3’，下游5’-CGATAAGCTGGGACCCGATGC-3’。2-△△Ct法计算circ_0092306相对于GAPDH、miR-411相对于U6的表达水平。

1.3.3 细胞分组转染:将对数生长期的AGS细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，采用LipofectamineTM 2000脂质体法，分别转染si-NC(si-NC组)、si-circ_0092306(si-circ_0092306组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-411(miR-411组)、共转染si-circ_0092306与anti-miR-NC(si-circ_0092306+anti-miR-NC组)、si-circ_0092306与anti-miR-411(si-circ_0092306+anti-miR-411组)。转染6 h后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞备用。

1.3.4 CCK-8法检测细胞增殖:转染后的各组细胞以0.5×104个/孔接种于96孔板中，培养24 h，加10 μl的CCK-8试剂。再孵育2 h，酶标仪450 nm测光密度(OD)值。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡:转染后的各组细胞以2.5×104个/孔接种于24孔板中，培养24 h，收集细胞。PBS清洗细胞2次，参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.6 Western Blot法检测蛋白表达:转染后的各组细胞以2.5×104个/孔接种于24孔板中，培养24 h，收集细胞。PBS清洗细胞2次，RIPA试剂提取细胞中总蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，行SDS-PAGE电泳，并将分离蛋白转至PVDF膜，且于5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h。然后分别置于CyclinD1(1∶500)、P21(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液中，4℃孵育过夜。再置于山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育液中，37℃孵育1 h。最后加显影液避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验:将对数生长期的AGS细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，采用LipofectamineTM 2000脂质体法，分别转染WT-circ_0092306与miR-411 mimics或miR-NC、MUT-circ_0092306与miR-411 mimics或miR-NC，转染6 h后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞，参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 circ_0092306和在胃癌组织和细胞中的表达 与癌旁组织比较，胃癌组织中circ_0092306表达升高(P<0.05)，miR-411表达降低(P<0.05)。与GES细胞比较，胃癌细胞系N87、HGC-27和AGS中circ_0092306表达升高(P<0.05)，miR-411表达降低(P<0.05)。见表1、2。

表1 circ_0092306和miR-411在胃癌组织中的表达

表2 circ_0092306在胃癌细胞中的表达

2.2 下调circ_0092306对AGS细胞增殖的影响 与si-NC组比较，si-circ_0092306组AGS细胞中circ_0092306表达降低(P<0.05)，细胞OD值、CyclinD1蛋白表达降低(P<0.05)，P21蛋白表达升高(P<0.05)。见表3，图1。

表3 下调circ_0092306对AGS细胞增殖的影响

图1 增殖相关蛋白表达

2.3 下调circ_0092306对AGS细胞凋亡的影响 与si-NC组比较，si-circ_0092306组AGS细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。见表4，图2。

表4 下调circ_0092306对AGS细胞凋亡的影响

2.4 下调circ_0092306对AGS细胞EMT的影响 与si-NC组比较，si-circ_0092306组AGS细胞中E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，Vimentin蛋白表达降低(P<0.05)。见图3，表5。

表5 下调circ_0092306对AGS细胞EMT的影响

2.5 circ_0092306靶向调控miR-411的表达 与共转染WT-circ_0092306与miR-NC的细胞比较，共转染WT-circ_0092306与miR-411 mimics的细胞荧光素酶活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与共转染MUT-circ_0092306与miR-NC的细胞比较，共转染MUT-circ_0092306与miR-411 mimics的细胞荧光素酶活性无显著变化，差异有统计学意义(P>0.05)。si-circ_0092306组AGS细胞中miR-411表达高于si-NC组(3.85±0.30比1.01±0.03，t=28.259，P<0.05)。见图4，表6。

2.6 上调miR-411对AGS细胞增殖、凋亡和EMT的影响 与miR-NC组比较，miR-411组AGS细胞中miR-411表达升高(P<0.05)，细胞OD值及CyclinD1、Bcl-2、Vimentin蛋白表达降低(P<0.05)，凋亡率及P21、Bax、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。见图5，表7、8。

图4 circ_0092306的序列中含有与miR-411互补的核苷酸序列

表6 双荧光素酶报告实验

图5 上调miR-411对AGS细胞增殖和凋亡的影响；A：增殖、凋亡相关蛋白表达；B：细胞凋亡流式图

表7 上调miR-411对AGS细胞增殖和凋亡的影响

表8 上调miR-411对AGS细胞增殖、凋亡和EMT相关蛋白表达的影响

2.7 下调miR-411逆转下调circ_0092306对AGS细胞增殖、凋亡和EMT的作用 与si-circ_0092306+anti-miR-NC组比较，si-circ_0092306+anti-miR-411组AGS细胞中miR-411表达降低(P<0.05)，细胞OD值及CyclinD1、Bcl-2、Vimentin蛋白表达升高(P<0.05)，凋亡率及P21、Bax、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。见图6，表9。

3 讨论

circRNA呈闭合环状结构，其结构稳定，且高度保守，参与调控细胞增殖、凋亡等生命活动，与肿瘤的发生发展密切相关[9]。研究已表明，多种circRNA在胃癌中异常表达，参与胃癌的发展进程。例如，Zhang等[10]研究显示，circDUSP16在胃癌组织中的表达水平明显升高，是胃癌患者生存不良的独立预后因素，敲除circDUSP16可抑制胃癌细胞活力、集落形成和侵袭，其作用机制与靶向结合miR-145-5p有关。Cai等[11]研究显示，circ_0000267在胃癌组织和细胞系中表达升高，且其高表达与肿瘤直径增加和局部淋巴结转移密切相关，上调circ_0000267可靶向结合miR-503-5p并上调HMGA2的表达加速了胃癌细胞的增殖、转移和EMT进程，促进了胃癌的发展进程。Xu等[12]研究显示，circ MTHFD2在耐培美曲塞(MTA)的胃癌细胞中表达升高，过表达circ MTHFD2可靶向结合miR-124诱导MDR-1的表达增强胃癌细胞耐药性。

图6 下调miR-411逆转下调circ_0092306对AGS细胞增殖、凋亡和EMT的作用；A 增殖、凋亡和EMT相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

表9 下调miR-411逆转下调circ_0092306对AGS细胞增殖、凋亡和EMT的作用

作为一种circRNA，目前对circ_0092306在肿瘤中发挥作用的研究较为少见。本研究显示，胃癌组织和细胞系中circ_0092306表达升高，下调circ_0092306降低胃癌细胞AGS的增殖能力及上皮间质转化过程，其促进AGS细胞凋亡，与Chen等[5]报道的结果一致。细胞增殖和凋亡受多种基因的调控。CyclinD1参与调控细胞周期，其表达增加加速细胞周期进程，促进细胞增殖。P21是目前公认的肿瘤抑制因子，其表达增加抑制细胞增殖。Bcl-2和Bax是细胞凋亡的重要调控分子，二者作用相反，Bcl-2表达升高抑制细胞凋亡，而Bax表达升高则加剧细胞凋亡[13]。本研究显示，下调circ_0092306抑制了AGS细胞中CyclinD1和Bcl-2蛋白的表达，促进了P21和Bax蛋白的表达，进一步说明下调circ_0092306抑制了胃癌细胞的增殖，且促进了细胞凋亡，circ_0092306可作为胃癌治疗的潜在分子靶点。

上皮间质转化(EMT)是上皮细胞失去极性获得间质细胞特性的过程，导致细胞骨架改变、细胞间黏附减弱、细胞的迁移能力增强。在EMT过程中，上皮标志物如E-cadherin表达降低，而Vimentin等间质标志物表达升高[14]。肿瘤细胞通过EMT获得由原位向周围侵袭的能力，最终进入血液和淋巴途径转移至远处形成新的病灶[15]。本研究显示，下调circ_0092306表达促进了胃癌细胞AGS中E-cadherin蛋白的表达，而抑制了Vimentin蛋白的表达，说明下调circ_0092306表达抑制了AGS细胞的上皮间质转化过程，降低细胞迁移和侵袭的可能，对延缓胃癌发展进程具有重要意义。

为了探究circ_0092306影响胃癌细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的分子机制，本研究利用双荧光素酶报告基因实验证实了circ_0092306可与miR-411靶向结合。同时上调circ_0092306表达抑制了AGS细胞中miR-411的表达，而下调circ_0092306表达则促进了miR-411表达，进一步说明了circ_0092306负调控miR-411表达。研究显示，miR-411在宫颈癌[16]、肾细胞癌[17]和卵巢癌[18]等肿瘤中表达下调，上调其表达可减弱肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为，抑制肿瘤的发展进程；而miR-411在骨肉瘤[19]、非小细胞肺癌[20]等肿瘤中表达上调，促进这些肿瘤的发展进程。本研究显示，miR-411在胃癌组织和细胞系中表达下调，上调其表达降低了胃癌细胞AGS的增殖能力及上皮间质转化过程，且促进了AGS细胞凋亡，与Bai等[21]报道的miR-411在胃癌细胞系中表达下调，过表达miR-411抑制胃癌细胞增殖、集落形成及迁移的结果一致，说明miR-411在胃癌中也发挥肿瘤抑制作用。本研究还显示，下调miR-411表达逆转了下调circ_0092306对AGS细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响，提示circ_0092306通过靶向负调控miR-411来影响胃癌细胞的恶性生物学行为。

综上，circ_0092306在胃癌组织和细胞系中表达升高，而miR-411表达降低；下调circ_0092306表达可靶向负调控miR-411来抑制胃癌细胞增殖及上皮间质转化，且诱导了胃癌细胞凋亡，circ_0092306/miR-411轴可能为胃癌的治疗提供了新的分子靶点。本研究接下来将进一步探究miR-411下游靶基因及信号通路对胃癌发生发展的影响，并通过裸鼠移植瘤实验验证circ_0092306/miR-411轴胃癌体内肿瘤生长的影响。