宿晶 王吉磊 刘世宾
肾间质纤维化(RIF)是糖尿病肾病(DN)最常见特征之一,其在糖尿病肾损伤早期出现,是DN等慢性肾病发展为终末期肾病的最终共同途径。因此,探讨RIF进展的分子机制对开发有效的DN治疗策略意义重大。长链非编码RNA(lncRNA)定义为一类长度超过200核苷酸蛋白编码潜能缺失的RNA转录本,其可在转录和转录后水平调节基因表达广泛参与表观遗传调控、细胞周期、细胞分化、凋亡等生物学过程[1]。lncRNAs的异常表达与包括DN在内的多种疾病进展有关[2]。生长抑制特异性转录本5(GAS5)是一种lncRNA,研究指出2型糖尿病患者外周血单核细胞中GAS5表达显著升高[3]。淋巴管内皮细胞中GAS5的表达差异可能与糖尿病相关并发症发病机制有关[4]。然而GAS5在RIF中的作用和分子机制鲜有报道。miR-136是一种与多种病理过程相关的非编码RNA,研究指出过表达miR-136显著抑制肾癌、肺癌细胞的上皮间质转化进程[5,6]。本研究通过生物信息学分析发现miR-136是GAS5的潜在靶基因,于是推测GAS5可能通过靶向miR-136参与调控RIF进程。因此,本研究以高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)建立RIF体外细胞模型[7],探讨GAS5靶向miR-136对高糖诱导的HK-2细胞炎性和纤维化因子表达的影响,以期为改善RIF、延缓DN进展提供有效靶点。
1.1 实验材料 人肾小管上皮细胞HK-2购于中国科学院上海细胞库;miR-136模拟物(mimics)、抑制物(anti-miR-136)以及相应对照(miR-NC、anti-miR-NC),GAS5小干扰RNA(Si-GAS5)、过表达质粒(pcDNA-GAS5)以及相应对照(Si-NC、pcDNA),荧光素酶报告载体购自上海吉玛制药公司;PrimeScript逆转录Master Mix购于大连TAKARA公司;Power SYBR Green PCR Master Mix购于美国ABI公司;IL-6、TNF-α酶联吸附测定(ELISA)试剂盒购于上海康朗生物公司;兔源肌动蛋白α(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN1)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体以及山羊抗兔IgG二抗购于北京博奥森生物公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与模型构建:HK-2细胞采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基,在37℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养。当细胞密度达到90%时,加入胰酶消化后按照1∶3比例接种新的培养瓶进行传代。用含30 mmol/L葡萄糖的培养液孵育HK-2细胞24 h建立RIF体外细胞模型[7],记为高糖(HG)组。
1.2.2 实时定量PCR(RT-qPCR)检测GAS5和miR-136表达水平:首先以TRIzol试剂提取HK-2细胞中总RNA,利用PrimeScript逆转录Master Mix合成互补DNA,再用Power SYBR Green PCR Master Mix进行RT-qPCR检测。2-ΔΔCt法分析GAS5和miR-136表达水平。GAS5上游引物5’-CCTGTGAGGTATGGTGCTGG-3’,下游引物5’-CTGTGTGCC AATGGCTTGAG-3’;内参GAPDH上游引物5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’,下游引物5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’;miR-136上游引物5’-ACUCCAUUUGUUUUGAU GAUGGA-3’,下游引物5’-UCCAUCAUCAAAACAAAUGGAGU-3’;内参U6上游引物5’-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3’,下游引物5’-GTACAACACATTGTTTCCTCG GA-3’。
1.2.3 细胞转染和实验分组:将对数期HK-2细胞铺96孔板,利用脂质体试剂分别将Si-NC、Si-GAS5、miR-NC、miR-136 mimics、Si-GAS5+anti-miR-NC、Si-GAS5+anti-miR-136转染50%融合的细胞,收获转染48 h细胞检测转染效果。用含5.5 mmol/L葡萄糖的培养液孵育HK-2细胞24 h记为正常对照(NC)组;HG组参照建模方法进行细胞处理;用含30 mmol/L葡萄糖的培养液孵育分别转染Si-NC、Si-GAS5、miR-NC、miR-136 mimics、Si-GAS5+anti-miR-NC、Si-GAS5+anti-miR-136的HK-2细胞24 h,依次记为Si-NC组、Si-GAS5组、miR-NC组、miR-136组、Si-GAS5+anti-miR-NC组、Si-GAS5+anti-miR-136组。
1.2.4 ELISA实验检测IL-6和TNF-α表达:胰酶消化各组细胞,3 000 r/min离心10 min收集细胞;用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞3次,用一定功率的超声波处理细胞悬液;再将带破碎细胞在-20℃下冰冻,室温溶解,反复3次,使细胞溶胀破碎。将标本于4℃离心机1 500 r/min离心10 min,收集上清按照试剂盒说明书检测IL-6和TNF-α表达量。
1.2.5 免疫印迹法检测α-SMA和FN1蛋白表达:RIPA裂解法处理HK-2细胞获得总蛋白,蛋白定量后利用SDS-PAGE电泳分离将蛋白样品分离开。随后用湿转移法将凝胶上的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上。室温下用5%脱脂牛奶孵育2 h后加入一抗溶液(α-SMA为1∶300,FN1为1∶500)4℃孵育膜过夜。然后加入山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)室温下孵育膜2 h。最后加入显影剂显色后,Image J软件分析灰度值。目的蛋白表达量为目的条带灰度值和内参GAPDH灰度值比值。
1.2.6 双荧光素酶报告实验:收集HK-2细胞接种于24孔板,当细胞密度达到50%时进行转染。用Lipofectamine 2000试剂将miR-NC、miR-136 mimics分别与WT-GAS5或MUT-GAS5共转染。孵育48 h后收获转染细胞,磷酸盐缓冲液洗涤后,然后使用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。同时将pcDNA、pcDNA-GAS5、Si-NC、Si-GAS5分别转染HK-2细胞,按照上述RT-qPCR步骤检测转染48 h细胞中miR-136表达量。
2.1 GAS5和miR-136在高糖诱导的HK-2细胞中的表达 与NC组比较,HG组HK-2细胞中GAS5表达量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),而miR-204-5p表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 GAS5和miR-136在高糖诱导的HK-2细胞中的表达
2.2 沉默GAS5对高糖诱导的HK-2细胞炎性与纤维化因子表达的影响 与NC组比较,HG组HK-2细胞GAS5表达量显著升高(P<0.05),IL-6和TNF-α表达显著升高(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表达量显著升高(P<0.05);与HG+Si-NC组比较,HG+Si-GAS5组HK-2细胞GAS5表达量显著降低(P<0.05),IL-6和TNF-α表达显著降低(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表达量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 沉默GAS5对高糖诱导的HK-2细胞炎性与纤维化因子表达的影响
2.3 GAS5靶向调控miR-136的表达 Starbase在线分析显示,GAS5序列中含有miR-136特异性结合位点。双荧光素酶报告实验显示,与转染miR-NC比较,转染miR-136显著降低HK-2细胞WT-GAS5的相对荧光素酶活性,差异有统计学意义(P<0.05),而对MUT-GAS5的相对荧光素酶活性无显著影响。pcDNA-GAS5组HK-2细胞miR-136表达量显著低于pcDNA组(P<0.05);Si-GAS5组HK-2细胞miR-136表达量显著高于Si-NC,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1,表3、4。
图1 GAS5中含有miR-136结合位点
表3 双荧光素酶报告实验
表4 lncRNA GAS5调控miR-136表达
2.4 过表达miR-136对高糖诱导的HK-2细胞炎性与纤维化因子表达的影响 与NC组比较,HG组HK-2细胞miR-136表达量显著降低(P<0.05),IL-6和TNF-α表达显著升高(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表达量显著升高(P<0.05);与HG+miR-NC组比较,HG+miR-136组HK-2细胞miR-136表达量显著升高(P<0.05),IL-6和TNF-α表达显著降低(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表达量显著降低(P<0.05)。见表5,图2。
图2 过表达miR-136对高糖诱导的纤维化因子的影响
表5 过表达miR-136对高糖诱导的HK-2细胞炎性与纤维化因子表达的影响
2.5 干扰miR-136表达逆转沉默GAS5对高糖诱导的HK-2细胞炎性与纤维化因子表达的影响 与HG+Si-GAS5+anti-miR-NC组比较,HG+Si-GAS5+anti-miR-136组HK-2细胞miR-136表达量显著降低,IL-6和TNF-α表达显著升高(P<0.05),α-SMA和FN1蛋白表达量显著升高(P<0.05)。见图3,表6。
图3 干扰miR136表达对高糖诱导的HK-2细胞纤维化因子表达的影响
表6 干扰miR136表达对高糖诱导的HK-2细胞炎性与纤维化因子表达的影响
GAS5最初从小鼠NIH3T3细胞分离得到,其在细胞增殖、生长阻滞、凋亡和自噬等多个生物学过程中发挥重要作用。近年研究证实GAS5表达失调与多种纤维化进程有关[8]。心肌纤维化组织和活化的心肌成纤维细胞中GAS5表达降低,恢复GAS5表达水平显著抑制心肌成纤维细胞增殖,降低MMP-2、a-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达,从而减轻心脏纤维化,改善心脏功能[8,9]。GAS5通过下调miR-23a表达调控信号通路抑制四氯化碳诱导的肝纤维化[10]。本研究发现高糖诱导后HK-2细胞中肌成纤维细胞标记物α-SMA、纤维化标志蛋白FN1表达水平显著增加,GAS5表达显著增加,提示GAS5表达改变可能与高糖诱导的RIF相关。转染Si-GAS5分析GAS5功能发现,沉默GAS5显著降低α-SMA和FN1蛋白表达水平,提示沉默GAS5可逆转高糖诱导的RIF。
TGF-β1是一种极强的促纤维化因子,Wang等[11]指出在TGF-β1诱导的HK-2细胞、链脲佐菌素诱导的DN小鼠肾组织中GAS5表达升高,沉默GAS5表达抑制转化生长因β1诱导的HK-2细胞纤维化,这与本研究发现的GAS5促纤维化作用一致。在DN中受损的肾小管上皮细胞、浸润的淋巴细胞可产生炎性因子加剧肾脏炎性反应,介导肾脏纤维化[12]。本研究发现沉默GAS5表达显著降低高糖诱导的HK-2细胞IL-6和TNF-α表达水平,说明沉默GAS5可抑制高糖诱导的HK-2细胞炎性反应。
lncRNA通过与miRNA相互作用影响miRNA活性进而调控多种生物学过程[13]。为探讨GAS5在高糖诱导的HK-2细胞炎症和纤维化中的可能机制,本研究通过Starbase数据库在线分析发现miR-136与GAS5序列存在结合位点,并通过双荧光素酶报告实验、RT-qPCR进一步证实GAS5对miR-136的靶向负调控作用。目前对miR-136研究多集中在肿瘤方面,研究显示口腔鳞状细胞癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌中miR-136表达降低,miR-136低表达促进癌细胞EMT进程[14-17]。
本研究发现高糖刺激显著降低HK-2细胞中miR-136表达水平,提示miR-136低表达可能与高糖诱导的RIF和炎性反应相关。转染miR-136 mimics进行功能验证显示,恢复miR-136表达显著削弱高糖刺激对HK-2细胞α-SMA、FN1、IL-6和TNF-α表达的影响,说明miR-136可抑制高糖诱导的HK-2纤维化因子表达和炎性反应,这与Liu等[18]报道的miR-136的抗纤维化作用基本吻合。深入研究发现,抑制miR-136表达还可逆转沉默GAS5对高糖诱导的HK-2细胞炎性与纤维化因子表达的影响,这进一步说明GAS5靶向miR-136在高糖诱导HK-2细胞炎性与纤维化因子表达中的的作用。
综上所述,本研究表明沉默GAS5可抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎性和纤维化因子表达,其机制与上调miR-136表达有关。因此,GAS5/miR-136途径是改善改善RIF、延缓DN进展的潜在靶点。