正交实验优选桑籽中1-脱氧野尻霉素的提取工艺

吕志强 李 乔 闫海龙 徐 文 赵振寰 巩丽丽 田景振▲

1.青岛大学附属医院药学部，山东青岛 266000；2. 青岛酒店管理职业技术学院总务处门诊部，山东青岛 266000；3.青岛妇女儿童医院康复科，山东青岛 266000；4.山东中医药大学药学院，山东济南 250355

桑籽为桑科植物桑（Morus aLba L.）的成熟果实的种子，桑树果实含籽量为2.8%。桑籽中含大量的脂类、氨基酸及丰富的微量元素及类黄酮物质，具有降血糖、调血压、调节植物神经等功效。桑葚加工后的残渣中大部分为桑籽，除了作为饲料外，其在食品、医疗工业方面仍存在极大开发利用空间。目前已有学者对桑类药材降血糖活性成分及其作用机理进行深入研究，发现其降血糖活性成分为多羟基生物碱[1]，其中以1-脱氧野尻（1-deoxynojirimycin，DNJ）为代表的多羟基生物碱是其重要的成分[2]，能够抑制α-葡萄糖苷酶活性[3-4]，较好地调节血糖代谢指标[5-6]，对于肝糖代谢的改善[7]、胰岛素抵抗的降低[8]，都具有明显的作用。但是相关文献对DNJ 的提取工艺如何最优化却鲜有报道，本实验采用盐酸乙醇作为提取剂，应用正交实验法比较不同提取条件对DNJ 提取率的影响，优选出了最佳提取工艺，拓展了桑资源研究的领域，为研发新药和保健食品提供了依据，并为相关课题的研究奠定基础。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

XP205 型十万分之一电子分析天平[瑞士梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；L-2000 高效液相色谱系统（日本株式会社日立制作所）；L-2400 型紫外检测器（日本株式会社日立制作所）；Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，中国北京迪科马科技有限公司）；RE52-99 旋转蒸发仪（中国上海亚荣生化仪器厂）；HWS24 双列四孔型仪表恒温水浴锅 （中国上海树立仪器仪表有限公司）；BS110S 型电子分析天平[德国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 试剂与材料

桑籽（来源于山东省蚕业研究所，经山东中医药大学教授周凤琴鉴定为桑科植物桑Morus aLba L.的成熟果实的种子[9]），样品分装后4℃贮存；DNJ 标准品（上海顺勃生物工程技术有限公司，纯度98%以上，生产批号：201103018）；乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司，生产批号：20121013）； 芴甲氧酰氯（Fmoc-Cl）（分析纯，上海晶纯生化科技股份有限公司，纯度99.7%，生产批号：39308）；冰乙酸（分析纯，天津市大茂化学试剂厂，生产批号：2010308）；氢氧化钾（分析纯，上海桃浦实业有限公司，生产批号：20090111）；硼酸（分析纯，天津博迪化工股份有限公司，生产批号：20091002）；甘氨酸（Glycine，Gly）（分析纯，天津大茂化学试剂厂，生产批号：20110107）；正己烷（分析纯，天津富宇精细化工有限公司，生产批号：20121107）。

2 方法与结果

2.1 供试品制备

桑籽经正己烷脱脂后，精确称取5.0026 g，加0.03 mol/L 50%的盐酸乙醇30 ml，80℃浸提1 h，提取两次，合并滤液，旋蒸至无醇味，离心，取上清液定溶至50 ml 量瓶中，摇匀，精密吸取100 μl 于1 ml 容量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2 DNJ 标准品的配制

精密称取DNJ 标准品置于容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，配得质量浓度0.491 mg/ml 的DNJ标准品溶液。

2.3 DNJ 的测定方法

2.3.1 DNJ 的衍生操作过程 精密吸取“2.1”项下的50 μl 供试品溶液，与50 μl 的0.4 mol/L 的硼酸钾缓冲溶液（pH 8.5）在试管中混合，然后加入100 μl 的5 mmol/L Fmoc-Cl 的乙腈溶液，迅速摇匀，在40℃水浴锅中反应20 min。加入50 μl 的0.1 mol/L 甘氨酸溶液中止反应，再加入4%（v/v）乙酸水溶液200 μl，以生成稳定的DNJ-Fmoc，经0.45 μm 微滤膜过滤后进行色谱分析。

2.3.2 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5 μm）；检测波长：254 nm；流动相：乙腈-0.1%乙酸溶液（55∶5）；柱温：30℃；进样体积：20 μl；流速：1.0 ml/min[10]。

2.3.3 供试品衍生化液相峰的确定 分别取“2.1”项下的50 μl 的供试品溶液、“2.1”项下的50 μl 供试品加入“2.2”项下的50 μl 标准品溶液，分别按照“2.3.1”项下的DNJ 的衍生操作方法处理，按照“2.3.2”项下的色谱条件测定（图1、2）；另外，再设Fmoc-Cl 对照（图3）和Gly 与Fmoc-Cl 络合物对照（图4），其中Fmoc-Cl 对照、Gly 与Fmoc-Cl 络合物对照不加DNJ 标准溶液。通过图1、2 峰面积值比较，发现加入标准品后只有峰2 的峰面积增加明显，峰2 为Fmoc-DNJ（Fmoc-Cl 与DNJ 反应生成的络合物）；通过图1、2、3、4 之间比较，可以断定峰3 为Fmoc-Gly；峰4 为Fmoc-Cl。

图1 供试品溶液色谱图

图2 供试品+标准品溶液色谱图

图3 Fmoc-Cl 对照组图谱

图4 Gly 与Fmoc-Cl 络合物对照组图谱

2.3.4 线性关系的考察 取标准品溶液，用去离子水稀释，分别配制成4.91、9.82、14.73、19.64、24.55、29.46、34.37、39.28 μg/ml 的标准品溶液。衍生化后按“2.3.2”项下的色谱条件分别测定峰面积，并以色谱峰面积（Y）对标准品浓度（X）进行回归，二者的回归方程为Y=4023.7X+2872.6，相关系数为R2=0.9995。可见DNJ 的浓度在4.91～39.28 μg/ml 内，其浓度和色谱峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度实验 精密吸取“2.2 项”下的DNJ 标准品溶液50 μl，衍生化后，重复测定6 份，测得峰面积RSD为1.777%。

2.3.6 稳定性实验 精密吸取“2.2”项下的DNJ 标准品溶液50 μl，按上述测定方法分别于0、3、6、9、12、15 h时测定，在15 h 内测得峰面积RSD=1.318%。

2.3.7 重现性实验 精密量取脱脂桑籽粉6 份，按“2.1项”下的供试品制备方法与“2.3.1”项下的DNJ 的衍生操作方法处理，按“2.3.2 项”下的色谱条件测定，测得DNJ 的平均含量为0.26%，RSD =2.027%。

2.3.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的脱脂桑籽药材粉末6 份，每份约0.3000 g，分别加入“2.2 项”下的DNJ 标准品，按照“2.1”项下的供试品制备方法与“2.3.1”项下的DNJ 的衍生操作方法处理，精密吸取50 μl 进行测定（表1）。

表1 加样回收率结果

2.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2.5 DNJ 提取的单因素实验考察及结果

2.5.1 DNJ 提取率计算方法 精密称取已烘干脱脂桑籽粉为ml，DNJ 测定按照上述DNJ 的测定方法操作进行，得m2，DNJ 提取率=m2×100/ml。

2.5.2 不同提取时间对桑籽中DNJ 提取率的影响 精密称取脱脂桑籽粉4 份，每份约5.0000 g，各加入0.03 mol/L 盐酸-50%乙醇溶液30 ml，80℃分别浸提0.5、1、1.5、2 h，提取两次，DNJ 的提取率依次为0.37%、0.38%、0.38%、0.38%。

2.5.3 提取次数对桑籽中DNJ 提取率的影响 精密称取脱脂桑籽粉4 份，每份约5.0000 g，各加入0.03 mol/L盐酸-50%乙醇溶液30 ml，80℃浸提1 h，分别提取1、2、3、4 次，DNJ 的提取率依次为0.37% 、0.38% 、0.38%、0.37%。

2.5.4 不同溶剂量对桑籽中DNJ 提取率的影响 精密称取脱脂桑籽粉4 份，每份约5.0000 g，各加入0.03 mol/L盐酸-50%乙醇溶液20、30、40、50 ml，80℃分别浸提1 h，提取两次，DNJ 的提取率依次为0.37%、0.38%、0.38%、0.38%。

2.5.5 不同提取温度对桑籽中DNJ 提取率的影响 精密称取脱脂桑籽粉5 份，每份约5.0000 g，各加入0.03 mol/L 盐酸—50%乙醇溶液30 ml，分别在50、60、70、80、90℃分别浸提1 h，提取两次，DNJ 的提取率依次为0.26%、0.32%、0.38%、0.38%、0.36%。随提取温度的增大，桑籽中DNJ 提取率逐渐增加，当提取温度为70℃与80℃，提取率最大，当温度继续增大至90℃时，提取率降低，故温度选择70℃与80℃。

2.5.6 不同乙醇浓度对桑籽中DNJ 提取率的影响 精密称取脱脂桑籽粉4 份，每份约5.0000 g，各加入0.03mol/L盐酸—10%、30%、50%、70%乙醇溶液30 ml，80℃浸提1 h，提取两次，DNJ 的提取率依次为0.22%、0.28%、0.38%、0.34%。DNJ 提取率在乙醇浓度为50%时最大。

2.5.7 不同盐酸浓度对桑籽中DNJ 提取率的影响 精密称取脱脂桑籽粉5 份，每份约5.0000 g，各加入0、0.01、0.03、0.05、0.07 mol/L 盐酸-50%乙醇溶液30 ml，80℃浸提1 h，提取两次，DNJ 的提取率依次为0.13%、0.20%、0.38%、0.40%、0.36%。随盐酸浓度的增加，桑籽DNJ 提取率逐渐增加，当盐酸浓度为0.05 mol/L时，提取率最大。

2.5.8 单因素方差分析 以提取率为因变量，影响因素1、2、3、4、5、6 对提取率的影响比较，差异无统计学意义 （F=1.496，P＞0.05）。影响因素1、2、3 的标准差较小，提取率比较接近；影响因素4、5、6 的标准差较大，提取率相差较大，故选择取浸提温度、乙醇浓度、盐酸浓度3 个因素做进一步的正交实验（表2、3）。

表2 描述性统计分析

表3 方差分析

2.6 DNJ 提取的正交实验结果

通过单因素实验考察，选取浸提温度（℃）、乙醇浓度（%）、盐酸浓度（mol/L）等3 个因素，每个因素选择3 个水平，进行正交实验考察（表4）。

表4 正交实验因素水平

以DNJ 提取率作为指标，按L9（34）正交表进行实验，探讨最佳提取工艺条件，正交实验结果如表5，方差分析结果见表6，以直观分析和方差分析判断各因素对DNJ 提取的影响程度，筛选最佳提取工艺。

表5 正交实验结果

表6 正交实验方差分析

由正交实验结果直观分析可见，3 个因素对DNJ提取率的影响程度依次为C＞B＞A。方差分析表明，因素C 影响最为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。浸提温度、乙醇浓度对实验影响较小。结合单因素实验，考虑节能省时等因素，最后优选桑葚籽中的DNJ 最佳提取工艺为C3B2A1。

2.7 提取工艺条件重复性实验

为确认上述工艺的稳定性，按照工艺盐酸浓度0.05 mo1/L，乙醇浓度50%，浸提温度70℃，重复实验3 次。测得DNJ 的提取率（表7）。

表7 重复性实验结果

3 讨论

我国桑资源丰富，桑籽具有降血糖、调血压、调节植物神经等功效，据相关文献研究表明其降血糖活性成分为以DNJ 为代表的多羟基生物碱。本实验项目曾对桑籽中总生物碱、总多糖、总黄酮的提取进行过研究，总生物碱的含量显著高于总黄酮、总多糖[11]。目前对DNJ 的含量测定方法主要有柱前衍生-高效液相色谱法[12-14]、高效液相色谱-串联质谱法[15]、高效液相色谱-蒸发光散射法[16]、离子色谱测定法[17]。本实验采用柱前衍生-高效液相色谱法测定DNJ 的含量，研究表明此测定方法重现性良好，相较于价格昂贵且较难配备的其他方法来说具有操作简单、经济有效的显著优势。

同时本实验对提取时间、溶剂量、提取次数等通过单因素实验考察分析，差异无统计学意义（P＞0.05）；进一步对盐酸浓度、乙醇浓度及浸提温度通过正交实验方差分析，盐酸浓度对DNJ 提取效果影响显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。而由正交实验极差分析可知，盐酸浓度对DNJ 提取效果影响最大，乙醇浓度次之，浸提温度影响最小。综合考虑各因素，确定了桑籽DNJ 最佳提取工艺参数为： 盐酸浓度0.05 mo1/L、乙醇浓度50%、浸提温度70℃。在此工艺条件下，桑葚籽DNJ 的提取率较高，为0.59%，与文献报道的DNJ提取率比较相近[1]。此提取工艺参数的确定为进一步拓展桑资源研究领域，研发新药和保健食品，提供了依据。

因受研究周期所限，本实验所收集桑籽的品种、产地相对单一。而桑籽作为药食同源的中药，其DNJ的含量亦不同程度的受品种、种植基地和采摘时间等多种因素影响，下一步本课题将进一步针对以上诸多影响因素进行深入研究，以期筛选出合适的种植基地及品种，指导桑农确定最佳采摘周期，为进一步提升桑籽的开发利用价值及规模化生产提供依据。