抗风湿镇痛类健康产品中吲哚美辛的快速筛查方法

魏志雄 刘丹丹 蓝明雄 王昆鹏

东莞市食品药品检验所，广东东莞 523808

吲哚美辛属芳基乙酸类非甾体抗炎药，为强力镇痛消炎药，对炎症性疼痛作用显著，临床主要用于对水杨酸类疗效不显或不易耐受的风湿性关节炎、强直性关节炎、骨关节炎等[1-3]。其长期或大量使用可引起皮肤过敏、胃肠道、中枢神经系统及造血系统反应等多种不良反应[4-6]。风湿病为常见多发病，易复发难根治，我国风湿病患者数量巨大，抗风湿镇痛类健康产品需求巨大，但目前市场存在着产品添加化学药物等乱象[7-13]，给人民群众的身体健康造成极大威胁。本研究采用显色反应法，旨在建立一种前处理简单、准确、灵敏、专属的抗风湿镇痛类健康产品中吲哚美辛的快速筛查方法，为监管部门打击假药劣药提供技术支撑，降低监管成本，提升监管效率。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AB 3200 Q-trap 液相色谱质谱联用仪（美国应用生物系统公司）；Sartorius CPA225D 电子天平（瑞士赛多利斯公司）；BRANSON 5510 R-MTH 超声波处理器（美国必能信公司）。

1.2 试药

吲哚美辛对照品（中国食品药品检定研究院；批号：100258-200904；含量：99.9%）；样品：112 批样品为监督抽检样品或由本所从市场采购（四种剂型，其中片剂27 批，颗粒剂5 批，胶囊剂61 批，丸剂19批）。乙腈（德国默克化工）、乙酸铵（上海麦克林生化科技）为色谱纯，甲醇（德国默克化工）、硫酸（广州化学试剂厂）、氢氧化钠（广州化学试剂厂）、三氯化铁（阿拉丁试剂有限公司）及30%过氧化氢溶液（广州市溢联化工有限公司）均为分析纯，水为超纯水。

2 方法及结果

2.1 显色反应法

2.1.1 取样 结合收集样品及市场流通样品的实际情况，方法建立的取样量及样品前处理见表1。其中，27批片剂中有4 批为红色包衣，3 批为深褐色包衣，取样时先用水洗去表层包衣颜色，减少干扰。

表1 不同剂型样品取样量及前处理

2.1.2 显色反应法实验溶液的制备

2.1.2.1 供试品溶液1 的制备 按“2.1.1 项”表1 所述取样品适量，放入内装0.4%氢氧化钠溶液4 ml 的玻璃瓶（A 瓶）中，闭塞，强力振摇约30 s，静置约30 s。用一次性吸管吸取A 瓶内上清液约1 ml，置内装3 mol/L硫酸溶液2 ml 的玻璃瓶（B 瓶）中，摇匀，静置约10～30 s。取一次性针头注射器吸取B 瓶溶液，经微孔滤膜（水系，25 mm，0.45 μm）滤过，滤液置离心管，收集滤液至约1 ml。

2.1.2.2 典型阴性对照溶液的制备 取壮骨强筋片（东莞市中医院；批号：20140927）按“2.1.2.1”项下方法制成典型阴性对照溶液。

2.1.2.3 对照品溶液的制备 取吲哚美辛对照品适量用0.4%氢氧化钠溶液制成对照品溶液（0.5 mg）。取典型阴性对照溶液加入等体积对照品溶液制得阳性对照溶液（0.25 mg）。

2.1.2.4 空白试剂的制备 不取样品，按“2.1.2.1”项下方法制成空白试剂溶液。

2.1.2.5 干扰溶液的制备 取抗风湿镇痛类常用药物双氯芬酸钠、布洛芬、保泰松、吡罗昔康、氨基比林、醋酸泼尼松、氢化可的松、地塞米松、阿司匹林、萘普生、甲氧苄啶及对乙酰氨基酚适量，分别用0.4%氢氧化钠溶液溶解成1 mg/ml 的溶液，作为干扰溶液。

2.1.3 显色反应法 向离心管中依次加入5%三氯化铁溶液及3%过氧化氢溶液各1 滴，静置10～30 s。观察接触面环的颜色变化（此时较为灵敏，观察结果有助于后续对浓度较低添加样品的判断），摇匀，再观察离心管溶液的颜色变化。

2.1.4 结果判断 若离心管溶液颜色变为淡红至紫红色，表明样品中含有吲哚美辛；若离心管溶液颜色无变化，表明样品中不含有吲哚美辛。如样品过滤后离心管溶液颜色本身偏红色时，需做样品随行对照，观察滴加反应试剂后颜色是否加深，如颜色不变或变淡，则判断为阴性；如红色加深，须进一步使用微孔滤膜（水系，25 mm，0.45 μm）滤过，如滤膜显示为淡红至紫红色，则判断为阳性。

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性 取阳性对照溶液、对照品溶液、典型阴性对照溶液及空白试剂依法显色，结果见图1 （封四）。离心管中阳性对照溶液及对照品溶液的颜色为淡红色，典型阴性对照溶液及空白试剂管中为浅黄色。同法制备其余样品的阴性对照溶液，依法显色，结果阴性对照溶液管为浅黄至棕褐色，均不显红色。

图1 专属性试验显色结果

取12 种干扰溶液依法显色，结果各溶液颜色均未变红，用微孔滤膜（水系，25 mm，0.45 μm）过滤，滤膜不显红色。试验结果表明阴性样品及同类抗风湿镇痛添加成分均无干扰，方法的专属性强。

2.2.2 检出限 采用阴性样品壮骨强筋片添加吲哚美辛对照品考察检出限，结果发现添加量在0.25 mg时，溶液能形成可供稳定辨别的淡粉红色。吲哚美辛成人一次口服起效剂量为25 mg，本法检出限为0.25 mg，仅为起效剂量的百分之一，故方法的灵敏度高。

2.3 样品快筛结果

对收集的112 批样品按2.1.2.1 项下方法进行快速筛查，结果有16 批样品检出吲哚美辛，详见表2。

表2 样品快速筛查阳性结果

2.4 液相色谱串联质谱法确证

2.4.1 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK C18MG Ⅲ（2.0 mm×150 mm，5 μm）；流动相：以0.02 mol/L 乙酸铵为流动相A，乙腈为流动相B，按下表3 梯度洗脱，流速：0.2 ml/min，柱温：35℃；进样体积：10 μl。

表3 色谱梯度洗脱程序

2.4.2 质谱条件 电离方式：负离子（ESI-）；扫描方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；气帘气（curtain gas，CUR）：25 psi；雾化气（ion source gas 1，GS1）：40 psi；辅助气（ion source gas 2，GS2）：40 psi；电离电压（ionspray voltage，IS）：-4500 V；辅助加热器温度：500℃；碰撞气体（collision gas，CAD）：Medium；出口电压（cell exit potential，CXP）：-2.0 V。

表4 吲哚美辛对照品的质谱条件

2.4.3 实验溶液制备

2.4.3.1 供试品溶液2 的制备 取表2 中产品的一次口服用量样品（包衣片除去包衣，研细；胶囊取内容物研细；丸剂剪碎，必要时用适量硅藻土分散；颗粒剂研细）置50 ml 容量瓶中，加甲醇25 ml，超声处理10 min，放冷至室温后再加水至刻度，摇匀，静置过夜。精密吸取静置后的上层溶液1 ml 置10 ml 容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜（有机系，13 mm，0.22 μm）滤过，制得供试品溶液2。

2.4.3.2 对照品溶液的制备 称取吲哚美辛对照品适量，用甲醇溶解并逐级稀释制成浓度约为500 ng/ml的吲哚美辛对照品溶液。

2.4.3.3 典型阴性对照溶液的制备 取壮骨强筋片按“2.4.3.1”项下方法制得典型阴性对照溶液。

2.4.3.4 空白溶液的制备 不取样品，按“2.4.3.1”项下方法制得空白溶液。

2.4.4 专属性与检出限 分别精密吸供试品溶液、吲哚美辛对照品溶液、 典型阴性对照溶液及空白溶液各10 μl 进样，记录提取离子流图。结果均未出现干扰，表明方法专属性良好，典型图谱见图2。

图2 液相色谱串联质谱法确证典型图谱

取1.0、2.0 及5.0 ng/ml 的吲哚美辛对照品溶液，分别取样注入液质联用仪分析，记录提取离子流图并计算信噪比S/N 值，至S/N≈3 为检出限，结果方法检出限为0.01 ng。

2.4.5 确证结果 通过液相色谱串联质谱法对快速筛查结果进行确证，结果见表5。方法的误检率及漏检率均为0，正确率为100%（n=112）[误检率=假阴性/（真阳性+假阴性）×100%；漏检率=假阳性/（假阳性+真阴性）×100%；正确率=（真阳性+真阴性）/（真阳性+假阳性+假阴性+真阴性）×100%]。

表5 快速筛查及确证结果汇总表（n）

3 讨论

中成药及保健品成分复杂，常规的理化鉴别反应灵敏度及专属性较差[14]。目前市面上已有的基本药物（吲哚美辛）快速筛查试剂盒整个操作过程耗时较长，且需使用恒温金属浴/水浴仪器加热，具有一定局限性；已有吲哚美辛ELISA 检测技术相关报道[15-17]，但尚不成熟。本方法利用吲哚美辛可被强酸碱液水解，生成对氯苯甲酸和5-甲氧-2-甲基吲哚-3-乙酸，并可进一步被氧化成有色物质的原理，合理设置试验步骤、提取及反应试剂，降低了其他成分的干扰，简化操作，缩短检测时间，提高了结果专属性与准确性。

对显色反应法前处理的各个步骤进行考察，最终选择质量百分比浓度为0.4%氢氧化钠溶液，此条件下提取效率最高；将0.4%氢氧化钠溶液和3 mol/L 硫酸溶液的用量比例设为2∶1，使既能达到稀释干扰物的目的，又可生成明显的紫红色物质，有利于结果判断；此外采用先加入硫酸溶液，过滤后再加入5%三氯化铁溶液，可消除硫酸酸化后生成的沉淀干扰；使用5%三氯化铁溶液及3%过氧化氢溶液作为显色试剂，可进一步加快反应速率，常温下一般在30 s 内可进行结果观察。通过对干扰样品的研究，加入简单的水洗前处理或随行对照，对方法进行优化补充，取得良好效果。

对低含量样品（以阴性样品加标的方式）进行了研究，取其“2.1.3 项”下离心管溶液用微孔滤膜（水系，25 mm，0.45 μm）滤过，观察滤膜的颜色变化，使检测的灵敏度进一步提高。滤膜如显淡粉红色至紫红色，可判断含吲哚美辛；滤膜如显其他颜色（一般为棕色或黄色），则判断不含吲哚美辛。按以上步骤判断，方法检出限可降低至0.1 mg/次。考虑到吲哚美辛常用口服剂量为25 mg/次，按“2.1 项”下方法定性鉴别反应所需吲哚美辛量仅为0.25 mg/次，已可满足吲哚美辛的鉴别灵敏度要求，考虑操作的简便性，故未将此滤膜判断方法列入。

本法无需使用有机溶剂，无需额外设备，无毒环保，可制成商品化的试剂盒，不仅可用于监管部门的现场筛查，而且可广泛应用于其他场所，具有较高的应用价值。