血管内皮生长因子基因rs699947位点多态性与汉族女性乳腺癌易感性的相关性

夏广韬 俞 洁 刘宇飞 郑立红 裴耘婕 张 龙 隋 茹 张明龙▲

1.齐齐哈尔医学院精神卫生学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院遗传学教研室，黑龙江齐齐哈尔161006；3.齐齐哈尔医学院基础医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006

乳腺癌是威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤，其发病机制至今尚未完全清楚，多项研究表明乳腺癌的发生机制与遗传易感基因的突变密切相关[1-2]，而单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）则是在进化中基因突变所导致遗传差异的主要形式，也是疾病易感性、药物敏感性等生物性状差异的重要遗传学基础[3]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为一种主要的血管生成因子，能够促进血管内皮细胞的增殖、分化，增加血管对大分子物质的通透性[4]。已有研究表明，VEGF 多态性可能影响VEGF 水平和活性，从而影响患乳腺癌在内的各种癌症的风险[5-8]。基于此，本研究选取VEGF 基因的rs699947 位点，分析其与汉族女性乳腺癌发病之间的关联性，以期为乳腺癌的防治、诊断和个体化治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年3月至2018年8月黑龙江省大庆油田总医院、齐齐哈尔医学院附属第二医院、齐齐哈尔医学院附属第三医院以及齐齐哈尔建华医院收治的258 例乳腺癌患者作为乳腺癌组，选取同期162 例健康女性作为对照组。乳腺癌组纳入标准：①女性患者，均为汉族，诊断年龄为18～70 岁；②经病理学检查明确诊断为乳腺癌，雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）情况明确；③无合并其他部位原发性肿瘤。对照组纳入标准：①健康个体，无肿瘤及癌前病变患者；②非病毒性肝炎、艾滋病患者。所有样本的采集和临床资料的获取均符合各医院和医学院的医学研究伦理委员会的要求，所有研究对象均已签署知情同意书。对乳腺癌组和对照组的基本特征信息进行采集，包括年龄、绝经史和肿瘤家族史，同时对乳腺癌的临床生物学特性资料进行统计，包括乳腺癌患者的肿瘤大小（T1～T4）、肿瘤分期（G1～G3）和淋巴结转移史（表1）。

表1 样本基本特征信息[n（%）]

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取和PCR 抽取对照组和乳腺癌组外周血2 ml，置于枸橼酸钠抗凝管中，-80℃条件下储存。采用小量全血基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因组DNA，采用Nano500 微量核酸分析仪（杭州奥盛仪器有限公司）对DNA 的纯度和浓度进行检测，以保证后续PCR 反应检测的质量需要。PCR：采用Sta 等[9]报道的方法对VEGF 基因rs699947 位点进行检测，引物序列（北京华大蛋白质研发中心有限公司）：通用正向引物：5'-CTAGTGCACGAATGATGGAAAGG-3'，野生型基因（C）引 物F：5'-TCAGTCTGATTATCCACCCAGATCT-3'，突变型基因（A）引物5'-TCAGTCTGATTATCCAC CCAGATCG-3'，扩增产物大小295 bp。PCR 反应体系（20 μl）：50 ng DNA 模板（2 μl），正、反向引物各1 μl，Buffer 2 μl，MgCl 2 μl，Taq 酶1 U（0.2 μl），dNTP mixture 2 μl，加纯化水至20 μl；PCR 热循环参数：95℃预变性5 min，循环内95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共循环35 次，72℃进一步延伸5 min，野生型和突变型基因的扩增条件均一致。

1.2.2 基因分型 同一DNA 样本需分别进行两次PCR，以分别扩增可能检出的野生型和（或）突变型基因，采用1.5%琼脂糖凝胶（上海默玺生物科技有限公司）电泳对PCR 产物进行电泳，以在295 bp 处是否出现条带作为判定标准，若两次PCR 反应的产物均为295 bp，则该样本基因型为AC，若单一PCR 反应产物为295 bp，则该样本基因型为AA 或CC。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2检验；两组的Hardy-Weinberg 定律检验采用拟合优度χ2检验； 采用logistic 回归分析各基因型和不同遗传模型与乳腺癌遗传易感的相关性，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组间的均衡性检验和Hardy-Weinberg 定律检验

对乳腺癌组和对照组的基本特征信息进行均衡性检验，结果显示：乳腺癌组的绝经比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；乳腺癌组有肿瘤家族史比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组的初潮年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。两组的Hardy-Weinberg 定律检验结果显示： 两组基因型分布的观察值与期望值比较，差异无统计学意义（χ2乳腺癌组=2.674，χ2对照组=3.629，P＞0.05），表明本研究选取的研究对象符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，符合群体遗传学研究的要求。

2.2 两组VEGF 基因rs699947 多态性与乳腺癌易感性分析

两组的rs699947 位点的等位基因频率、 基因型频率分布和不同遗传模型的比较分析以及风险预测见表2，结果显示：两组的等位基因和基因型分布比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。对年龄、绝经与否和肿瘤家族史等因素予以校正后，携带基因型AC 和AA 的个体发生乳腺癌的风险分别为0.341（P＜0.05）和0.170（P＜0.05）。校正相关混杂因素后，两组的显性模型（AA+AC/CC）和隐性模型（CC/AC+AA）比较，差异有统计学意义（P＜0.05），显性模型和隐性模型下对乳腺癌的风险预测值分别为0.276 和2.657（P＜0.05）。

表2 VEGF 基因rs699947 位点等位基因和基因型分布及不同遗传模式下对乳腺癌易感性的风险预测

2.3 乳腺癌组VEGF 基因rs699947 多态性与临床生物学特性的关系

rs699947 位点的基因型分布与肿瘤分期、淋巴结转移阳性率、肿瘤大小、雌、孕激素受体阳性率和组织病理分型无明显相关性（P＞0.05）（表3）。

表3 乳腺癌组患者VEGF 基因rs699947 多态性与乳腺癌生物学特性的关系

3 讨论

VEGF 基因可通过多种机制促进血管的生成，已被证明在肿瘤发生、 发展和预后中起着关键作用[10]，有研究报道VEGF 在乳腺癌中过度表达[11-12]与微血管密度增加和乳腺癌复发有关[13]，并且VEGF 基因单核苷酸多态性可以通过影响蛋白表达，进而影响肿瘤的易感性和严重程度[14]。Rahoui 等[15]对摩洛哥女性的研究结果发现A 等位基因携带者降低了患乳腺癌的风险，而Jacobs 等[16]已经证明C 等位基因与美国人群中浸润性导管癌的风险增加有关，但与原位癌或整体乳腺癌无关；与之矛盾的是，Kapahi 等[17-19]的研究显示，AA 基因型与北印度人群、 伊朗人群和沙特阿拉伯人群乳腺癌的发病风险增高有关，Sa 等[20-21]对巴基斯坦人群和西班牙人群的研究发现，血管内皮生长因子基因多态性与乳腺癌的关联不大。基于以上研究结果分析，VEGF 基因rs699947 位点多态性在世界范围内的不同人种和群体中存在着差异。基于此，本研究探讨VEGF 基因rs699947 位点多态性与汉族女性群体乳腺癌易感性的关系，结果显示VEGF 基因rs699947位点的多态性分布与乳腺癌易感性明显相关，且携带AA 和AC 基因型的个体患乳腺癌的风险分别降低0.170 倍和0.341 倍。本研究采用不同遗传模型进行验证，证实rs699947 的多态性与乳腺癌易感性相关联，显性模型的结果表明携带AA 和AC 基因型是携带CC 基因型个体发病风险的0.276 倍； 而与此相对应的隐性模型的结果表明携带CC 基因型是携带AC/AA 基因型个体发病风险的2.657 倍。因此，可以认为携带AC 和AA 基因型能够降低乳腺癌的发病风险，是乳腺癌易感性的保护性因素之一。

为进一步研究rs699947 位点多态性与乳腺癌发展和预后间的关联，本研究将rs699947 位点的基因型分布与乳腺癌的临床生物学特性进行比较，结果显示基因型分布与肿瘤分期和大小、乳腺癌淋巴结转移以及雌、孕激素受体阳性率等乳腺癌生物学特征均不具有相关性，说明rs699947 位点多态性与乳腺癌的发展和预后无明显关联。

本研究尚存在一些不足：首先，本研究的人群均为汉族，由于不同研究人群可能有不同的遗传背景及生活方式，因此rs699947 位点多态性对乳腺癌易感性的影响可能在世界范围内存在较大差异； 其次，纳入分层分析的患者数量不足，有待于更大样本纳入，结果可能会更显著；最后，本研究只纳入了rs699947一个多态性位点，没有考虑位于其他基因与其连锁的多态性位点，不排除与之连锁的多态位点共同作用影响乳腺癌的发病。

综上所述，VEGF 基因rs699947 多态性与乳腺癌的易感性具有显著关联，基因型AC 和AA 是乳腺癌发病的保护因素。这些发现为根据SNP rs699947 基因型评估乳腺癌发病风险提供前期研究数据，有望为个体化医疗打下基础。