耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌流行病学调查与耐药性分析

李少媚 吴森泉 张嘉文 赖应昌 黎雪晶 姜义荣▲

1.广东省东莞市人民医院血液淋巴瘤科，广东东莞 523000；2.广东省东莞市人民医院呼吸与危重症医学科，广东东莞 523000；3.广东省东莞市人民医院检验科，广东东莞 523000

耐碳青霉烯类肠杆菌（carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE）包含70多种细菌，该类肠杆菌科细菌能够产生碳青霉烯酶进而对碳青霉烯类抗生素产生耐药性[1]。自2001年首例携带肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（klebsiella pneunwniae carbapenemase，KPC）的CRE被报道，世界范围内关于CRE感染的报道越来越多见[2]。目前市面上绝大多数抗菌药物对CRE的抗菌活性均较差，无药可用成为CRE感染者死亡的重要原因，而随着临床碳青霉烯类抗生素应用的增加，进一步增加CRE的检出率[3]。本研究回顾性分析2014年1月至2019年12月东莞市人民医院CRE耐药情况，以期为临床用药及院感防控提供借鉴。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集2014年1月至2019年12月东莞市人民医院送检标本中分离的83株耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌，标本共对应83例临床患者，年龄1～85岁，平均（56.25±6.75）岁。质控菌株为肺炎克雷伯菌（批号：ATCC 700579/ BAA-1805）、大肠埃希菌（批号：ATCC 25799）。

1.2 药敏分析及菌种鉴定

采用VITEK-2 型全自动微生物分析系统（法国生物梅里埃公司）对进行菌种鉴定及药敏分析，参照美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S27 标准[4]进行结果判读，使用改良Hodge试验（modified Hodge test，MHT）[5]对待测菌碳青霉烯酶阳性情况进行检测，试验阳性即提示该菌株产碳青霉烯酶。

1.3 碳青霉烯酶基因检测

制备模板DNA（煮沸法），以聚合酶链式反应（PCR）扩增碳青霉烯酶基因；扩增体系为Premix Taq（大连宝生物工程有限公司）50 μl，引物各 1 μl，Premix Taq 25 μl，灭菌双蒸水 21 μl，模板2 μl。反应条件：①blaIMP：置于94℃下变性5 min、94℃变性 45 s、55.5℃变性 45 s、72℃变性 1 min，30个循环后，于72℃下延伸10 min；②blaVIM：置于 94℃下变性 5 min、94℃变性 45 s、56℃变性 45 s、72℃变性1 min，30个循环后，于72℃下延伸10 min；③blaKPC：置于94℃下变性5 min、94℃变性1 min、56℃变性 1 min、72℃变性 1 min，30 个循环后，于 72℃下延伸10 min；④blaOXA-48：置于94℃下变性5 min、94℃变性 45 s、48.5℃变性 45 s、72℃变性 1 min，32 个循环后，于72℃下延伸5 min。采用UVP一体化凝胶成像系统（美国GelDoc-ItTS3）对PCR产物进行分析。各基因对应引物序列及产物长度见表1。

表1 碳青霉烯酶基因引物序列

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，采用t检验；计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验；采用WHONET 5.6进行耐药性分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株来源分析

83株CRE标本来自尿液33株（39.76%）、痰液 16株（19.28%）、血 液 15株（18.07%）、胆 汁4株（4.82%）、分泌物8株（9.64%）、鼻腔拭子 1株（1.20%）、支气管肺泡灌洗液1株（1.20%）、腹水1株（1.20%）、粪便1株（1.20%）、其他3株（3.61%）；其中尿液、痰液、血液中CRE菌株占比最高，三种途径菌株共计64株，占总数的77.11%（64/83）。

2.2 CRE菌种分布分析

83株CRE当中肺炎克雷伯菌（36株）、大肠埃希菌（20株）、阴沟肠杆菌（14株）占比最高，三种病原菌共计70株，占总数的84.34%（70/83）。见表2。

表2 CRE菌种分布

2.3 碳青霉烯酶基因检测结果

36株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中检出携带碳青霉烯酶基因的菌株共31株，检出率为86.11%（31/36），其中 blaKPC 30株、blaVIM 4株、blaIMP 4株、blaOXA-48 0株，检出率分别为83.33%、11.11%、11.11%、0；检出率最高的碳青霉烯酶基因为KPC（30株），检出率高达83.33%。有一例同时携带KPC、VIM、IMP三种碳青霉烯酶基因，有3例同时携带IMP、KPC，有1例同时携带VIM、KPC。部分KPC基因的结果见图1。

图1 部分KPC基因的结果

2.4 CRE耐药性分析

耐药性分析结果显示对CRE敏感率最高的三种抗菌药物为阿米卡星、庆大霉素、呋喃妥因，敏感率分别为69.88%、37.35%、37.35%；有6种抗菌药物（氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑啉、亚胺培南、厄他培南）对CRE的敏感率为0，有2种抗菌药物（氨苄西林、头孢替坦）对CRE的敏感率＜ 10.00%。见表3。

表3 CRE耐药性分析

3 讨论

碳青霉烯类抗生素是目前临床抗菌效果最好、抗菌谱最广的一类抗生素，被认为是治疗多重耐 药 菌（multi-drug resistant bacteria，MDROS）感染的最有效药物，大大提高了MDROS感染患者生存率及预后水平。尽管碳青霉烯类抗生素对大部分MDROS具有良好抗菌活性，但CRE却对其余大部分抗生素具有耐药性，因此临床又称其为“超级细菌”[6-8]。人体感染CRE后病原菌会侵入人体组织及血液，并在体内不断繁殖导致体内正常细胞组织死亡而引起人体组织、器官出现功能障碍和炎症反应。长期使用各类抗生素进行治疗的患者体内病原菌发生变异的概率更高，因此这部分患者感染CRE的风险也更高[9-10]。人体一旦发生CRE感染，由于缺乏有效抗菌药物，后果往往较为严重，因此，临床为提高这部分感染者的治疗效果通常主张采用多种抗菌药物联合使用以尽早杀灭病原菌，提高患者预后水平。

大量研究证实CRE对市面上绝大多数抗菌药物均具有耐药性，其对哌拉西林/他唑巴 坦（tazobactam-piperacillin，TZP）、氨 曲 南（Aztreonam，ATM）等常见抗生素的耐药率达到 90% 以上，对头孢他啶（Ceftazidime，CAZ）、头孢西丁（cefoxitin，FOX）等的耐药率也高达80%以上，无药可用也使得CRE感染者具有较高的病死率[11-13]。而本研究耐药性分析结果显示，TZP、头孢曲松、头孢他啶、头孢唑啉、亚胺培南、厄他培南对CRE的敏感率为0，氨苄西林、头孢替坦对CRE的敏感率＜10.00%，这与既往研究结果基本一致，这也进一步验证了CRE对抗菌药物的高耐药性[14-15]。此外，本研究结果还显示，肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌三种病原菌占总菌株的比值高达84.34%，而其中以肺炎克雷伯菌最多，临床可通过对上述三种CRE病原菌进行针对性研究以降低CRE感染率，提高CRE感染者治疗效果。本文主要针对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行耐药性基因检测，结果显示，36株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中检出携带碳青霉烯酶基因的菌株共31株，检出率为86.11%，其中检出率最高的碳青霉烯酶基因为KPC，检出率高达83.33%，这与王青等[16]的研究对应，这一结果提示bla-KPC基因或为CRE对碳青霉烯类抗生素具有耐药性的最主要原因。值得关注的是，本研究耐药性分析显示对CRE敏感率最高的三种抗菌药物为阿米卡星、庆大霉素、呋喃妥因，敏感率分别为69.88%、37.35%、37.35%，这也提示上述三种抗菌药物或对CRE感染治疗具有临床价值。本研究通过对CRE菌种分布、碳青霉烯酶基因分布及耐药性展开分析，可为临床CRE检出患者抗菌药物种类的选择及整体治疗方案的制订提供参考依据，具有一定现实意义。但是，本研究受人员、经费及研究时间等限制，存在样本量小、实验数据较单一等局限性，可能导致结果与临床实际存在偏差，仍存在进一步拓展研究价值。

综上所述，KPC基因是检出率最高的碳青霉烯酶基因，而阿米卡星、庆大霉素、呋喃妥因对CRE敏感率分别达到69.88%、37.35%、37.35%，以上三种抗菌药物对临床CRE感染治疗具有积极意义。此外，合理使用抗菌药物，提高院感防控力度是降低CRE感染的有效手段。