彭海兰 黄梦丹 林桂兰 黄之文 罗爱华 黄 平
1.广东省高州市人民医院妇二科,广东高州 525200;2.广东省高州市人民医院检验科,广东高州 525200;3.广东省高州市人民医院病理科,广东高州 525200
宫颈癌属于妇科常见恶性肿瘤,发病率位居女性恶性肿瘤第3位,病死率高,对女性生命健康威胁严重[1]。研究指出,宫颈上皮内瘤变(CIN)时期是预防宫颈癌发生的黄金时期,在此时期进行干预可减少宫颈癌发生[2]。近年来,随着诊断水平的提升,研究发现高危型人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA可反映病毒的致癌活性,检测HPV E6/E7 mRNA可为临床诊断提供一定依据[3]。另有研究指出,p16/Ki-67双染检测技术能有效检出宫颈癌前病变,可降低宫颈癌前病变漏诊率[4]。两者均对宫颈病变诊断具有一定价值,但两者联合应用是否可进一步提升诊断效能的临床研究甚少。基于此,本研究选取高州市人民医院收治的200例高危型HPV感染患者进行研究,旨在探究HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测的诊断价值。现报道如下。
本研究经高州市人民医院医学伦理委员会审核通过。选取2020年1月至2021年4月高州市人民医院收治的200例高危型HPV感染患者作为研究对象,年龄21~60岁,平均(40.52±5.88)岁;体重指数 18.9~ 27.7 kg/m2,平均(23.56±1.51)kg/m2;孕次0~4次,平均(1.95±0.47)次。
纳入标准:①均为高州市人民医院收治的高危型HPV感染女性,均存在不同程度下腹坠胀感、分泌物增多、阴道不规则出血、白带增多等症状;②均接受病理组织检查并明确病情;③均行HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测;④检查前3 d内无性生活、阴道用药;⑤宫颈完整;⑥均知情本研究,并签署同意书。排除标准:①合并重要器官功能障碍者;②精神异常、认知功能障碍者;③血液、免疫系统疾病者;④妊娠、哺乳期女性;⑤伴其他恶性肿瘤者。
1.3.1 仪器及试剂盒 广州安必平医药科技股份有限公司提供p16/Ki-67试剂盒(批号:2007001);广州安必平医药科技股份有限公司提供HPV E6/E7 mRNA试剂盒(批号:2105009);广州安必平医药科技股份有限公司提供液基细胞仪(型号:DC-4212,序列号:KS-GD-0099)、生物显微镜(型号:CX43,序列号:9J51154)、多功能流式点阵仪(型号:Luminex 200,序列号:10017272422);深圳市金科威实业有限公司提供阴道窥镜(型号:Slc-2000B)。
1.3.2 标本采集及制片 采用阴道张开器或窥阴镜使阴道充分暴露,收集足量分泌物、脱落细胞制成洗脱液,取1 ml液体置于HPV E6/E7 mRNA检测试管中,剩余液体制备2张宫颈细胞学薄片分别进行细胞学检查及p16/Ki-67双染检测。
1.3.3 p16/Ki-67双染检测 利用免疫细胞化学双染法的原理进行检测,病理科医师在显微镜下阅片,若视野中出现至少1个宫颈细胞的细胞质呈红色(p16),细胞核呈黄色或棕色(Ki-67)则判读为阳性;p16/Ki-67双染检测阳性标准:p16、Ki-67同时出现在一个细胞内,胞核红染、胞质棕黄染为阳性;只有一个显色或无显色为阴性。
1.3.4 HPV E6/E7 mRNA 采用多功能流式点阵仪实施扩增、显色,再在扩增体系中加入1 μl DNA抽提液,按照试剂盒扩增程序持续进行扩增反应,计算机读取检测结果,其中HPV E6/E7 mRNA拷贝数< 1.0 copy/ml为阴性,反之为阳性。
1.3.5 细胞学检查 采用液基细胞仪进行涂片染色,由专业医师按照《子宫颈细胞学Bethesda报告系统》[5]对涂片进行分析,分为未见上皮内病变或恶性病变(NILM)、未确定意义的非典型鳞状上皮细胞病变(ASCUS)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、浸润癌。
1.3.6 病理组织检查 将阴道窥镜置入阴道,暴露阴道与宫颈连接部位,观察宫颈形态、大小等情况,采用阴道镜放大子宫颈图片,采用5%乙酸进行涂抹,在异常处取病理组织放入中性福尔马林缓冲液中固定8 h,再实施石蜡包埋切片、染色,进行病理学诊断,依据《WHO女性生殖器官肿瘤学分类(第4版)解读》[6]对宫颈组织学诊断结果实施评估,分为宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、浸润癌,其中NILM、CINⅠ为阴性,CINⅡ、CINⅢ、浸润癌为阳性。
①记录病理组织检查、细胞学检查、HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性结果。②比较不同细胞学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率。③比较不同病理学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率。④比较不同HPV E6/E7 mRNA表达情况患者p16/Ki-67双染检测阳性率。⑤分析HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测的关系。⑥以病理组织检查为“金标准”,统计HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测及联合检查对CINⅡ+的检查结果及诊断效能。联合检查阳性标准:任意单一检查为阳性即为阳性。CINⅡ+是指CINⅡ、CINⅢ、浸润癌。敏感度=真阳性例数/(真阳性+假阴性)例数×100%;特异度=真阴性例数/(真阴性+假阳性)例数×100%;准确度=(真阳性+真阴性)例数/(真阳性+假阴性+真阴性+假阳性)例数×100%。
采用SPSS 21.0统计学软件处理数据,计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验,计数资料以[n(%)]表示,采用χ2检验,多因素分析采用logistic回归分析法。P< 0.05表示差异有统计学意义。
200例宫颈病变患者经病理组织检查证实 宫 颈 炎 54例、CINⅠ 45例、CINⅡ 39例、CINⅢ33例、浸润癌29例;经细胞学检查证实NILM 51例、ASCUS 41例、LSIL 31例、HSIL 47例、浸润癌30例;经HPV E6/E7 mRNA检出92例阳性,108例阴性;经p16/Ki-67双染检测检出84例阳性,116例阴性。
随细胞学诊断级别的提升,HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率逐渐增加,差异有统计学意义(P< 0.05)。见表1。
表1 不同细胞学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率比较[n(%)]
随病理学诊断级别提升,HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测阳性率逐渐增加,差异有统计学意义(P< 0.05)。见表2。
表2 不同病理学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率比较[n(%)]
HPV E6/E7 mRNA阳性患者的体重指数、p16/Ki-67双染检测阳性率高于阴性患者,差异有统计学意义(P< 0.05);HPV E6/E7 mRNA 阳性、阴性患者间年龄、孕次比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。见表3。将体重指数、p16/Ki-67双染阳性占比作为自变量,HPV E6/E7 mRNA表达情况作为因变量纳入多因素logistic回归模型,结果显示,p16/Ki-67双染阳性为HPV E6/E7 mRNA阳性的危险因素。见表4~5。
表3 HPV E6/E7 mRNA阳性的单因素分析
表4 变量赋值
表5 HPV E6/E7 mRNA阳性的多因素分析
联合检查诊断CINⅡ+敏感度高于HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测单独诊断,差异有统计学意义(P< 0.05)。见表6 ~ 7。
表6 HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测及联合检查的检查结果
表7 诊断效能[%(n/N)]
近年来随人们饮食习惯及生活方式改变,宫颈癌发病率逐渐增加且趋于年轻化,对女性生命健康产生严重威胁[7-8]。宫颈癌发生、发展时间较长,由癌前病变发展为宫颈癌需十年以上的时间[9]。因此及时发现癌前病变并准确鉴别,对减少宫颈癌发生、提高治疗效果、改善预后十分重要。
宫颈活检为诊断宫颈病变的“金标准”,但其为有创检查,且取材局限,导致患者难以接受,不利于疾病筛查[10]。因此,找寻一种简单、快速、准确地诊断宫颈病变的方式对患者十分重要。HPV E6/E7 mRNA为宫颈癌及癌前病变的致病因素,有研究指出,女性感染HPV后,约40%患者会发生宫颈上皮内瘤病变,且持续感染者病变率更高,因此测定患者HPV感染情况有助于区分宫颈病变等级[11]。p16属于抑癌基因,在多种肿瘤疾病中,p16均存在缺失、突变,造成细胞周期紊乱,细胞无限生长,引发癌变,但单独p16诊断仍依赖于细胞形态;Ki-67是反映细胞增殖的标志物,在正常细胞内p16、Ki-67不会同时表达,但其在宫颈高级别病变中具有较高的一致性,通过检测HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67表达情况可对宫颈病变进行诊断鉴别[12-13]。本研究通过分析不同细胞学、病理学类型的宫颈病变患者HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染阳性表达情况发现,随细胞学、病理学诊断级别的提升,HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染阳性率逐渐增加(P< 0.05),这一结果与国外 Celewicz等[14]研究结果一致,提示HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染阳性表达情况可一定程度地反映患者病变程度。本研究分析HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测结果关系发现,HPV E6/E7 mRNA阳性患者p16/Ki-67双染阳性率高于HPV E6/E7 mRNA阴性患者,这与国外相关研究类似[15]。这是由于女性感染HPV病毒后,病毒基因可与宿主基因发生整合,形成致癌蛋白E7,可影响细胞周期循环,使细胞增殖不受控制,导致p16过表达,且p16/Ki-67与HPV感染导致的癌性转化有关[16]。
本研究进一步分析HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测的诊断价值发现,联合检查诊断CINⅡ+敏感度高于HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测单独诊断(P< 0.05),由此说明联合 HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测诊断可提升对CINⅡ+的敏感度,有利于早期及时筛查,并制订针对性干预措施,以降低宫颈癌发生率。
综上所述,HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测联合用于诊断CINⅡ+的诊断价值敏感度更高,可为宫颈癌前病变筛查提供指导,同时可显著降低阴道镜转诊率,减少不必要的阴道镜转诊,防止过度诊断,协助临床医师对患者进行准确分层管理,进而实现患者早期干预。p16/Ki-67和HPV E6 /E7 mRNA作为宫颈病变发生、发展中重要的生物学标志物,其无创的检测特点受到患者的普遍认可。p16/Ki-67双染检测和HPV E6/E7 mRNA结果易于判读、具有更好的重复性和简便性,其临床应用价值较高。本研究存在一定不足,在后期的工作将继续扩大样本容量,深入研究p16/Ki-67双染检测、HPV E6/E7 mRNA和联合检测与宫颈癌前病变患者转归的相关性,以期更合理地对宫颈病变患者进行有效诊治。