皮瓣缺血再灌注损伤的相关机制研究进展＊

王海刚，何志军

（1.甘肃省中医药大学，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050）

随着交通运输业、工业和农业的飞速发展，高能量开放性损伤呈逐渐增多的趋势。此类损伤以肢体大面积缺损合并骨骼、肌腱、神经血管外露断裂等为特点，常常处理棘手。皮瓣移植技术作为显微外科和整形外科手术中的常用技术，可以有效解决皮肤大面积缺损，但皮瓣移植术后常常发生皮瓣坏死，有文献报道，乳房切除术后皮瓣坏死的发生率在5%～30%[1]，而缺血再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion，I/R）是导致皮瓣坏死的主要因素，也是目前在显微外科领域及器官移植领域研究的热点。皮瓣是重大创伤和整形外科重要的修复手段，然皮瓣坏死屡见不鲜，究其原因，I/R是导致皮瓣坏死的主要因素，因此如何有效防治皮瓣坏死及提高皮瓣移植术后皮瓣的生存率是临床的重大难题。目前认为，I/R的发生机制主要包括活性氧类物质产生、中性粒细胞大量聚集、钙超载以及细胞凋亡，经常被认为是由多细胞介导、多种基因共同调控而发挥作用的一系列复杂的反应过程。文章将对近年来中西医防治皮瓣缺血再灌注损伤的相关机制研究进行综述，旨在为皮瓣的缺血再灌注损伤的研究提供理论依据和新的思路。

1 活性氧类物质产生

I/R过程中会产生大量活性氧物质（ROS），ROS主要的有害类型包括超氧阴离子（O2）、羟基自由基（OH）和过氧化氢（H2O2）。Denham教授在2009年的一篇文献综述中系统总结并讨论了衰老自由基理论的起源与演变，该学说认为衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的[2]。自由基是指能独立存在的，含一个或一个以上不配对电子的任何原子或原子团。人体内自由基常以氮或氧的形式存在，即氮自由基和氧自由基，其中多数以氧自由基的形式存在。研究发现，组织在I/R过程中产生大量氧自由基，并在组织内发生级联反应，使活性氧代谢产物不断增多而发生无复流现象[3]，最终对组织、细胞造成不同程度破坏，也就是说，超过一定时限的缺血可以导致皮瓣不可逆的组织坏死。皮瓣在发生缺血再灌注损伤时机体内存在三种氧化应激途径，氧化应激可由酶源和非酶源产生，常见的酶源包括内皮细胞黄嘌呤氧化酶系统、中性粒细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原酶（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）系统、一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）系统[4]。非酶源是氧化应激的次要来源，包括肌红蛋白和血红蛋白，主要表现在四肢损伤。而这三种氧化应激途径均以氧分子作为电子受体，结果产生大量的氧自由基，氧自由基通过自噬、有丝分裂、坏死和细胞凋亡四种途径导致细胞死亡，参与皮瓣缺血再灌注损伤。

1.1 黄嘌呤氧化酶系统

黄嘌呤氧化还原酶是复杂的钼黄酶，在嘌呤分解代谢中起重要作用，这种酶在人体中以两种可互换的形式存在，即黄嘌呤脱氢酶（Xanthine Dehydrogenase，XDH）和黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XO），在正常健康组织中以XDH为主。嘌呤代谢可通过两种主要途径启动，第一种为通过三磷酸腺苷（ATP）被脱氨酶转化为肌苷单磷酸，脱磷酸化后形成肌苷，嘌呤可以通过去除一个磷酸基而变成腺苷并转化为肌苷，肌苷进一步转化为次黄嘌呤，然后氧化为黄嘌呤。第二种为鸟嘌呤转化而成。不管何种方式，XO尤其重要，因为它们的活性伴随着活性氧的产生，这些酶有2种形式：使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作为电子受体的黄嘌呤脱氢酶和通常使用O2作为受体的黄嘌呤氧化酶[5]。在正常组织中，次黄嘌呤在氧化为黄嘌呤的过程中，NAD+和O2同时减少，并由黄嘌呤脱氢酶产生NADH（NAD+的还原态）。但缺血状态下，XDH由于ATP水平较低而转移到黄嘌呤氧化还原酶，当血流恢复供应时，XO以氧为最终电子受体，与O2反应，在黄嘌呤氧化酶途径下，黄嘌呤氧化酶通过将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，继而催化黄嘌呤转化为尿酸，黄嘌呤和尿酸的形成过程中，会释放超氧化物（O2－）和过氧化氢（H2O2），导致更多的氧化应激。次黄嘌呤和黄嘌呤是嘌呤代谢在缺血组织中积累的2种特征较为明确的产物。Chouchani等[6]在研究I/R下不同组织中（肝、肾、心、脑）代谢特征的变化中分析显示只有三种代谢物大量聚集：次黄嘌呤、黄嘌呤和琥珀酸，这证实了灌注时嘌呤代谢物可用于氧化介导ROS的产生。ROS引起氧化应激，损伤内皮细胞和DNA，并造成局部炎症反应，氧自由基反应一旦发生，机体就会发生一系列连锁反应，这也是氧自由基反应的最显著的特点，进而诱发细胞因子风暴，导致细胞结构损伤和细胞死亡[7]。随着炎症级联反应和氧化应激的不断扩大化，氧自由基可破坏细胞膜脂质，降低细胞质质液流动性，使细胞中多种酶的生物活性受到抑制。此外，氧自由基还能干预细胞中脂质与蛋白质之间，蛋白质与蛋白质之间的正常化学反应，使ATP生成减少，影响细胞的正常能量代谢，促进细胞膜的损伤，进而加重皮瓣缺血再灌注损伤。

1.2 中性粒细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原酶（NADPH）系统

缺血再灌注状态下线粒体损伤和电解质失衡促进了NADPH氧化酶系统，NADPH氧化酶的双氧化酶（Nox/Duox）家族参与此过程中I/R的发生，该家族多蛋白复合物由7个成员组成，分别为Nox-1到Nox-5，以及双氧化酶（Duox）-1和（Duox）-2[8]。血流再灌注状态下，NOX酶立即产生O2－，并通过酶将其转化为H2O2，H2O2通过细胞膜氧化半胱氨酸，灭活酪氨酸磷酸酶和丝氨酸苏氨酸磷酸酶钙调磷酸酶，与过氧化物酶反应，引起细胞毒性。缺氧还可诱导缺氧抑制因子-1α（HIF-1α）促进Nox酶的激活,氧化应激可增加HIF-1α的生成，从而建立正反馈回路。此外，当血流恢复后，细胞释放多种化学介质激活NADPH氧化酶，如磷脂酶A2，TNF-α，IL-1β、干扰素-γ等，磷脂酶A2的释放诱发血小板激活因子的生产，导致细胞中白细胞三烯含量上升，促进炎症发生。缺血后组织中Nox衍生的ROS可引起炎性细胞积累，此外，巨噬细胞和肥大细胞产生的细胞因子促进NADPH氧化酶的过表达，血管紧张素还可刺激局部血管紧张素受体增加NADPH氧化酶的表达，通过血管紧张素转换酶导致缺血-再灌注损伤[9]。在炎症反应过程中，随着巨噬细胞和其他免疫细胞的浸润，这些免疫细胞中NADPH氧化酶的激活有助于产生ROS，当再灌注过程中发生时称为氧爆[10]。NADPH氧化酶在血管内皮细胞中产生ROS，当恢复血流时，大量的氧气聚集加速氧化应激,实验研究表明，氧化应激可激活细胞色素c介导的凋亡信号通路，诱导缺血再灌注过程中DNA损伤、蛋白结构和功能改变以及脂质过氧化[11]。

1.3 一氧化氮合酶（NOS）系统

一氧化氮（NO）被认为是一种重要的细胞内和细胞间生物活性分子，在体内发挥多种生理和病理生理功能，目前比较公认的NOS类型有3种：神经元NOS（nNOS）、内皮NOS（eNOS）以及诱导型NOS（iNOS）[12]，nNOS和eNOS存在于内皮细胞和神经细胞，对钙离子有依赖性，iNOS主要存在于中性粒细胞及巨噬细胞中，对钙离子无依赖性，其中源于iNOS的NO主要参与皮瓣缺血再灌注的病理过程。NO在皮瓣缺血再灌注过程中的作用是双面的，也就是说，它既可以对缺血皮瓣起到保护作用，也可以加快皮瓣缺血坏死的进程。生理状态下，这3种NOS系统通过将l -精氨酸转化为l -瓜氨酸而产生NO，NO通过其抗氧化、抗炎功能发挥对皮瓣组织的保护作用，然而，当组织在缺血状态下，血管内皮细胞功能失调，eNOS生成NO减少或无法生成NO。在此阶段，NO可被氧化为硝酸盐以及亚硝酸盐，大量自由基再组织中积累，产生炎性反应和强烈的细胞毒性最终加重缺血再灌注损伤[13]。当组织中NO含量处于低浓度时，形成的少量的硝基过氧化物可以通过谷胱甘肽途径促进NO再生成，此时NO的氧化产物无明显的细胞毒性，并且还可以通过调血管内皮细胞的通透性、抑制血小板聚集、清除氧自由基和血管收缩等机制对缺血组织起到保护作用。随着缺血进一步加重，eNOS系统不再产生NO，iNOS诱导的NO生成途径被激活，此时NO在形成硝基过氧化物时，一部分NO会形成超氧化物歧化酶（SOD），随着氧自由基大量积累，高浓度硝基过氧化物相应的组织蛋白和脂质结合形成脂质过氧化物，导致细胞损伤并加重皮瓣缺血再灌注损伤。

2 中性粒细胞大量聚集

皮瓣缺血再灌注损伤的另一重要损伤机制就是中性粒细胞的大量聚集。在缺血再灌注期间，皮瓣发生强烈的炎症反应，这种炎症反应由缺血期开始，但主要发生在再灌注期，以大量中性粒细胞聚集为特征。研究表明，清除过多的中性粒细胞或抑制其功能可减轻皮瓣损伤和炎症[14]。在炎症反应期，缺血皮瓣中白细胞数量大量升高，中性粒细胞是白细胞中最大的循环部分，也是最先到达损伤部位的细胞，中性粒细胞渗出过程可分为滚动、黏附和移行3个阶段，这往往是一系列多级级联反应，包括中性粒细胞沿着血管壁的滚动以及与血管内皮细胞牢固黏附并向外迁移。中性粒细胞数量随着缺血时间的延长而逐渐增加，当血流再灌注发生后几分钟内，滚动黏附中性粒细胞数量剧增，促进炎性细胞向组织的转移[25]。在此过程中，中性粒细胞分泌多种细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF-α、TGF-β）、白细胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-l0）等，TNF-α是炎症反应过程中出现最重要、最早的炎症介质，TNF-α激活中性粒细胞使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放，是炎性反应的促发剂，促进中性粒细胞脱释放弹性蛋白酶，使皮瓣局部出现组织水肿、出血坏死等病理变化，并损伤内皮细胞，使微循环血流淤滞，组织坏死，造成器官功能损伤。罗小凤[15]通过动物实验发现，应用p38MAPK 抑制剂SB202190 可以减轻皮瓣的炎症损伤，提高大鼠皮瓣存活率，其机制可能与SB202190阻断了p38MAPK信号通路，并减少了TNFα及增加了IL-10的含量有关。也有学者[16]报道，淫羊藿苷可以选择性阻断皮瓣缺血再灌注过程中NF-κB信号通路，明显降低大鼠血清及组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，显著提高大鼠皮瓣存活率，说明淫羊藿苷是通过抑制皮瓣组织炎症因子的释放，改善了皮瓣缺血再灌注损伤。目前课题组基于VEGFDll4/Notch信号通路及p38MAPK-PPARγ/NF-κB信号通路探讨消肿止痛合剂对于I/R损伤的作用机制研究已取得重大突破[17]，也证实了靶向阻断p38MAPK信号通路后，可以提高大鼠的皮瓣存活率。

中性粒细胞转运到缺血部位直至再灌注过程中涉及一系列复杂的病理变化，当再灌注发生时，氧和血源性免疫细胞重新注入组织，中性粒细胞显著增加，氧在再灌注过程中是XO和NADPH氧化酶生成活性氧的必需底物，而中性粒细胞由于坏死细胞释放的危险信号和炎性介质进入缺血的组织中，促进血源性免疫细胞与血管内皮细胞之间的黏附作用，随后在迁移到缺血组织中，被激活的中性粒细胞一旦移动到缺血组织中，就会产生NADPH氧化酶依赖的呼吸爆发[18]，呼吸爆发可产生大量的氧自由基，氧自由基可破坏细胞膜脂质，造成皮瓣组织中细胞大量坏死，而再灌注发生时又可引起中性粒细胞大量聚集，进一步加重中性粒细胞的局部浸润。由此可见，呼吸爆发所导致的恶性循环可以对血管、细胞及皮瓣组织产生广泛的损伤。通过这一复杂的病理机制，中性粒细胞浸润诱导再灌注损伤，从而放大缺血引起的细胞损伤，在此渗出过程中，中性粒细胞还可分泌多种炎性介质，炎性介质是组织发生炎症时由局部组织或血浆产生和释放的参与炎症反应的具有化学活性的物质，也称化学介质。炎性介质包括外源性和内源性两类，组织中以内源性介质居多。组织中的内源性炎性介质在致炎因子的作用下大量释放，并变为具有生物活性的物质，在皮瓣缺血再灌注的发生过程中起重要的介导作用。最常见的炎性介质有花生四烯酸（AA）、白细胞三烯（LT）、补体等，炎性介质在皮瓣缺血再灌注过程中起积极作用，可使血管扩张、血管壁通透性升高，促进白细胞趋向破坏，导致炎性充血和渗出等变化。与此同时，皮瓣组织内的肥大细胞和巨噬细胞被激活，这些炎性介质进一步促进中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附作用，导致皮瓣局部出现水肿、出血及坏死，从而加重血流灌注不足。课题组前期研究发现，消肿止痛合剂对由缺氧所致大鼠皮瓣血管内皮细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能是通过调控VEGF-Dll4/Notch信号转导通路来发挥治疗作用[19]。

3 钙超载

由各种原因引起的细胞内Ca2+浓度高于细胞外而导致的细胞结构、功能以及代谢障碍，称为钙超载[20]。研究发现，皮瓣缺血再灌注过程中普遍存在钙超载现象，且与线粒体功能障碍由密切关系，线粒体是细胞内一切生命活动的“调控中心”，是制造能量和细胞进行有氧呼吸的主要场所，能干预ATP 的合成和影响脂质氧化，线粒体还可以储存Ca2+，可以和内质网、基质等结构共同作用，来控制细胞中的Ca2+浓度的动态平衡。缺血再灌注时，细胞主要为无氧呼吸，ATP损耗大幅增加，钠泵活性降低，细胞内pH下降,钠离子过多,为了纠正细胞内外酸碱平衡，细胞通过质膜的Na+/H+交换调整细胞内酸度、通过Na+/Ca2+交换维持细胞内外Na+平衡，导致Ca2+离子通道开放，细胞内Ca2+增多，细胞内外Ca2+梯度差增大[21]，Ca2+内流增加，细胞内Ca2+大量聚集，机体为了维持细胞内外渗透压的平衡，在线粒体的作用下，胞浆内的Ca2+进入细胞内，造成细胞内的钙超载，这一结果使粒体内磷酸钙大量沉积，影响ATP合成，导致线粒体生成ATP减少，钙转运功能障碍，促进钙超载发生。

另外，皮瓣在缺血再灌注状态下，细胞内钙超载，钙依赖性蛋白酶被激活，钙依赖性蛋白酶是一种重要的中介物质，可以调控钙离子通道开放。在钙依赖性蛋白酶的作用下，细胞内ROS生成增加，损害组织细胞。前面提到，当皮瓣发生缺血再灌注时机体发生氧化应激反应而释放大量ROS，ROS可通过细胞内脂质过氧化反应造成细胞膜的损伤，氧化应激过程中，黄嘌呤脱氢酶（XDH）转化为黄嘌呤氧化酶（XO）、同时ATP在分解过程中产生次黄嘌呤，此过程均可产生氧自由基[22]，而氧自由基的过量产生则可导致细胞损伤或死亡。机体在缺血缺氧状态下会抑制电子通过线粒体呼吸链的流动，使ATP生成减少，缺血引起的氧化磷酸化也可抑制脂肪酸的分解和氧化，当脂肪酸在细胞内积累时，就会促进炎性因子花生四烯酸的代谢，并促进线粒体膜通透性转换孔开放（mPTP）的开放，mPTP是存在于线粒体内外膜之间的具有通透性的非特异转换孔，mPTP开放与关闭是维持线粒体膜电位关键，皮瓣缺血时mPTP关闭，再灌注时mPTP开放，在缺血再灌注初期，mPTP保持关闭状态而在再灌注期因线粒体的钙与磷酸盐的沉积、氧化应激和pH的恢复而开放，并促使ROS迅速产生，导致线粒体钙超载，进而诱导mPTP打开使线粒体膜电位去极化，随着mPTP大量开放，大量胞质内的溶质分子进入线粒体，使得线粒体内氧化磷酸化脱偶联，呼吸链解偶联[23]，膜电位紊乱，同时会释放各种促细胞凋亡因子，破坏线粒体膜的生物结构，线粒体结构受损，功能异常，导致能量代谢障碍，而这种结构和功能的破坏则是线粒体不可逆性损伤的标志，最终导致细胞凋亡或细胞死亡。

4 细胞凋亡

细胞凋亡是指机体为了维持内环境稳定，由基因控制的一系列细胞自主有序的死亡[24]。细胞凋亡与细胞坏死有本质区别，细胞凋亡是主动过程，它由基因调控表达，是机体为更好地适应环境而自发的一种死亡过程，细胞凋亡作为细胞死亡的一种特殊方式，是正常的生物学现象，在细胞的新陈代谢中起着必要的作用，一般不伴随局部炎症。而细胞坏死是被动的、不受基因管制的一种细胞死亡形式，其特征是细胞胀大、破裂、内容物渗出，并且可引起局部炎症反应，大多由物理、化学因素或外部环境的骤变引起。凋亡可导致细胞的形态学改变，如细胞收缩，细胞表面微绒毛突起、皱褶消失，凋亡小体[25]形成，凋亡小体迅速被巨噬细胞或其他邻近细胞吞噬和清除。凋亡还可导致细胞生化性质的改变，如DNA片段化、染色质凝结和边缘化等，是判断凋亡发生的客观指标。

现有研究证明，皮瓣缺血再灌注损伤时存在细胞凋亡现象，且由多种机制介导，其主要途径：外源性途径和内源性途径，2种途径通常相互影响。外源性途径也称为死亡受体途径，是指由特定的跨膜受体（称为死亡受体）与配体结合而触发的信号通路，被死亡受体和与其同源的配体激活，最常见的有肿瘤坏死因子（TNF-α）、死亡受体（FAS）、凋亡诱导受体（TRAILR1和TRAILR2）等，死亡受体途径通过激活一种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase-8），裂解caspase-3，切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键使DNA降解，最终导致细胞程序性死亡。内源性途径由细胞内物质应激触发，包括DNA损伤、氧化应激、生长因子和内质网应激等，无论由何种性质应激所触发，最后这些细胞内的信号途径都汇聚在线粒体上，导致线粒体功能障碍，所以内源性途径也称为线粒体途径[26]。线粒体途径受到B淋巴细胞瘤基因（Bcl-2）家族的调控，该家族线粒体水平及其上游发挥作用，Bcl-2按其功能不同可分为3个亚类，第一类包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1；第二类包括促凋亡蛋白Bok、Bax和Bak；第三类包括具有活化功能的蛋白Bid、Bim、Bik、Noxa、Puma（BH3-only蛋白），3类蛋白协同作用，其中缺乏任何一种蛋白类型细胞凋亡都无法顺利进行。在皮瓣发生缺血再灌注过程中，胞浆细胞增多并与Bcl-2和Bcl-XL结合，根据不同的细胞内应激信号，BH3-only亚类成员被激活，并参与Bax与Bak的激活[27]，使其允许它们插入线粒体外膜并融合成大分子复合物，从而导致线粒体外膜通透化（MOMP），MOMP是本途径的关键，线粒体膜的通透化伴随凋亡基因如细胞色素c、凋亡诱导因子的大量释放，进而激活了位于下游的Caspase片段，此片段活化后可切割细胞内的蛋白结构，从而启动凋亡程序，调节细胞凋亡。

5 小结

皮瓣缺血再灌注损伤是皮瓣移植术后皮瓣坏死的主要原因，是经常困扰临床医生的难题。近年来，I/R损伤的相关机制被广泛研究，以期为I/R的治疗提供新的思路，但皮瓣缺血再灌注损伤涉及多种损伤机制，是一系列病理变化所导致的级联反应，多种损伤机制往往互为因果，且恶性循环。文章重点讨论了活性氧的产生以及细胞凋亡机制，有一点需要强调，线粒体在I/R中扮演着举足轻重的角色，首先，皮瓣在缺血状态下，线粒体的呼吸链功能障碍导致ATP生成减少，进而导致细胞正常生理活动减弱，细胞Ca2+潴留，细胞肿胀坏死。其次，上述三大系统通过氧化应激反应损伤线粒体结构，使线粒体的氧化磷酸化发生障碍，ROS生成增多，线粒体清除能力减弱而导致ROS过多积累，最终导致细胞死亡。值得注意的是，现阶段绝大多数的机制研究都是基于某一损伤机制的单方面研究，尽管此类研究已经很深入，但由于I/R损伤机制是由多因子、多细胞、多信号通路交互作用的结果，现阶段尚缺乏大规模的有关多机制的实验研究，仅单方面的损伤机制研究无法更好地指导临床治疗。未来，应深入研究以线粒体为中心的多机制相交互的协同作用，为临床治疗I/R提供新的思路。